TRI Reagent®溶液(也以TRIzol的名称出售)是硫氰酸胍和苯酚的单相溶液混合物,可用于从人、动物、植物、酵母、细菌和病毒生物样品中分离DNA、RNA和蛋白质。其可抑制RNase活性。TRI Reagent®用于匀浆提取RNA、DNA或蛋白质的生物样品。
1A. 组织:
在Polytron®或其他合适的均质器中,在TRI Reagent(每50-100mg组织1ml)中均质化组织样品。
注意:如果需要最小量的DNA剪切,请使用松散型均质器,而不是Polytron(参见DNA分离,步骤3,注释b)。组织的体积不应超过TRI Reagent体积的10%。
1B.单层细胞:
直接在培养皿上裂解细胞。每10 cm2玻璃培养板表面积使用1 ml TRI Reagent。加入试剂后,应使用移液管抽吸细胞裂解液数次,以形成均质裂解物。
注意:TRI Reagent与塑料培养板不兼容。
1C.悬浮细胞:
通过离心分离细胞,然后通过重复移液使其在TRI Reagent中裂解。1 ml试剂足以裂解5–10 × 106个动物、植物或酵母细胞或107个细菌细胞。
注意:
相分离:为确保核蛋白复合物完全解离,使样品在室温下静置5分钟。每ml TRI Reagent加入0.1ml 1溴-3氯丙烷或0.2ml氯仿(参见相分离,注释a和b)。紧紧盖住样品,剧烈摇动15秒,并在室温下静置2-15分钟。将所得混合物以12,000 × g、2-8℃离心15分钟。离心将混合物分成3个相:红色有机相(含有蛋白质),中间相(含有DNA)和无色上层水相(含有RNA)。
注意:
1.将水相上清液转移到新管中,每ml用于制备步骤1中的TRI Reagent加入0.5ml 2-丙醇,混合。让样品在室温下静置5-10分钟。在2-8℃下以12,000 × g离心10分钟。RNA沉淀在管的侧面和底部。
注意:将中间相和有机相储存在2-8°C,以备用于随后的DNA和蛋白质分离。
2.去除上清液,在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中至少加入1 ml 75%乙醇来洗涤RNA沉淀。涡旋样品,然后在2-8°C下以7,500 × g离心5分钟。
注意:
3.通过风干或真空将RNA沉淀短暂干燥5-10分钟。不要让RNA沉淀完全干燥,否则会大大降低其溶解度。请勿在真空(Speed-Vac®)下离心干燥RNA沉淀。向RNA沉淀中加入适量的甲酰胺、水或0.5% SDS溶液。为了促进溶解,用微量移液管在55-60℃下反复吹打10-15分钟以混合。
注意:
1.小心地去除与中间相重叠的水相并丢弃。为了从中间相和有机相中沉淀DNA,在每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent中加入0.3ml 100%乙醇。倒置混合并在室温下静置2-3分钟。在2-8℃下以2,000 × g离心5分钟。
注意:在DNA沉淀之前去除剩余的水相是保证分离DNA质量的关键步骤。
2.去除上清液,保存在2-8°C,以备进行蛋白质分离。用0.1M柠檬酸三钠、10%乙醇溶液洗涤DNA沉淀两次。对每1 ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent使用1ml洗涤溶液。在每次洗涤期间,使DNA沉淀静置(偶尔混合)至少30分钟。在2-8℃下以2,000 × g离心5分钟。将DNA沉淀重悬于75%乙醇(每ml TRI Reagent1.5-2 ml)中,并在室温下静置10-20分钟。
注意:
3.在真空下将DNA沉淀干燥5-10分钟,并溶解于8mM NaOH中,用微量移液管反复缓慢移液混合。加入足量8mM NaOH,使最终DNA浓度为0.2-0.3 mg / mL(对于从50-70 mg组织或10<sup>7</sup>个细胞中分离的DNA,通常为0.3-0.6 ml)。这种温和的碱性溶液可确保DNA沉淀完全溶解。以12,000 × g离心10分钟,以除去任何不溶物质,并将上清液转移到新管中。
注意:
1.每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent,用1.5ml 2-丙醇,从苯酚-乙醇上清液(DNA分离,步骤2)沉淀蛋白质(参见注释)。使样品在室温下静默至少10分钟。在2-8℃下以12,000 × g离心10分钟。
注意:对于某些样品,蛋白质沉淀可能难以溶解在1% SDS(步骤3)中。使用下列步骤来解决这一问题:
2.弃去上清液,并在0.3M盐酸胍 / 95%乙醇溶液中洗涤沉淀团3次,每1ml用于样品制备步骤1的TRI Reagent用2ml洗涤溶液。在每次洗涤期间,室温下将样品在洗涤溶液中储存20分钟。在2-8℃下以7,500 × g离心5分钟。洗涤3次后,加入2ml 100%乙醇,并涡旋蛋白质沉淀。在室温下静置20分钟。在2-8℃下以7,500 × g离心5分钟。
注意:悬浮在0.3 M盐酸胍 / 95%乙醇溶液或100%乙醇中的蛋白质样品可在2-8°C下储存1个月或在-20°C下储存1年。
3.在真空下干燥蛋白质沉淀5-10分钟。将沉淀团溶解在1% SDS中,将微量移液管吸头置于溶液中,移动柱塞帮助溶解。在2-8℃下以10,000 × g离心10分钟,以除去任何不溶物质。将上清液转移到新管中。蛋白质溶液应立即用于Western blotting或储存在-20°C下。
1.RNA分离:
A. 低产率可能是由于:
B. 如果A260 / A280比率<1.65:
C. 如果RNA降解:
D. 如果有DNA污染:
2.DNA分离:
A. 低产率可能是由于:
B. 如果A260 / A280比率<1.70:
C. 如果DNA降解:
D. 如果有RNA污染:
3.蛋白质分离:
A. 低产率可能是由于:
B. 如果蛋白质降解:
C. 如果PAGE显示条带变形:
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