植酸酶的酶促检测(EC 3.1.3.8)

文档记录

源自操作步骤SSPHYT02。包括模板根据现行SOP规范更新和整合注意事项到操作步骤。参阅SOP-DEK-ENZ18。

1.目标

该程序的目的在于测定植酸酶（货号P9792）的活性。

2.适用范围

本操作步骤的适用范围包括以下反应：
植酸 + H₂O    ^植酸酶   > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + P_i

3.定义

3.1.    纯水 - 来自去离子系统的水，电阻率>或= 18MΩcm @ 25 °C。

3.2.    p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP = p-肌-肌醇 1,2,4,5,6- 五磷酸

3.3.    植酸 = 肌-肌醇六（二氢磷酸）

3.4.    P_i = 无机磷酸盐

3.5.    植酸酶的单位定义 = 在pH 2.5、37 °C下，一个单位每分钟将从4.2 X 10^-2 M植酸中释放1.0 μmol无机磷酸。

4.讨论

4.1.    植酸 + H₂O    ^植酸酶   > p-myo-inositol 1,2,4,5,6-PKP + P_i

4.2.    方法 = 比色测定，温度 (T) = 37°C，pH = 2.5，A_400nm，光程 = 1cm

5.责任

我们所有工作人员都有责任遵循本书面操作规程。

6.安全

测定开始之前，请参阅每种化学品的MSDS。

7.操作流程

7.1 试剂

7.1.1  200 mM甘氨酸缓冲液，pH 2.8、37 °C（缓冲液）

7.1.1.1.    配制100 mL，用纯水溶解甘氨酸，盐酸，货号 G7126。

7.1.1.2.    用1 M NaOH或1 M HCl将pH在37 °C下调至2.5。

7.1.2.     44.1 mM植酸溶液，pH 2.5、37 °C(植酸)

7.1.2.1.    配制 10 mL，试剂7.1.1溶解植酸，二钾盐，货号 P5681。

7.1.2.2.    用1M HCl将pH在37 °C下调至2.5。

7.1.3.    5% (w/v) 钼酸铵溶液（Amm Moly）
配制100 mL，纯水溶解钼酸，四水铵盐，货号 M0878。

7.1.4  5N 硫酸溶液
配制 100 mL，纯水溶解硫酸，95-98%，A.C.S.试剂，货号258105。

7.1.5  丙酮
使用丙酮，A.C.S.试剂级，货号 179124。

7.1.6 显色剂 (CRS)

7.1.6.1  配制100 mL，25 ml试剂7.1.3加入到25 mL试剂7.1.4和50 mL试剂7.1.5。

7.1.6.2 混匀并立即使用。

7.1.6.3 新鲜配制。

7.1.7  50 mM磷酸钾溶液 (P Std.)
配制10 mL，用去离子水溶解磷酸钾，一元，无水，货号P5379。

7.1.8    植酸酶溶液(酶)
现用现配，用低温试剂7.1.1配制包含0.5-2.0单位/mL植酸酶的溶液。

7.2.     步骤——空白/试样制备

7.2.1.     将下列试剂移液转入（按ml）一个4 dram小瓶(vial)：

7.2.2.     平衡到37 °C，然后添加：

7.2.3.    立即倒置混匀并在37 °C下孵育整整30min。然后添加：

7.2.4.    涡旋混匀，然后将溶液转移到适宜的容器中，使用适宜的分光光度计记录试样和空白样的A_400nm。

7.3.    步骤-标准曲线：

7.3.1 将下列试剂移液转入（按ml）适宜的容器中：

7.3.2 涡旋混匀并在37 °C下孵育30分钟。然后添加：

7.3.3  涡旋混匀，然后将溶液转移到合适的比色皿中，使用适宜的分光光度计记录标准样和标准空白样的A_400nm。

7.4.    计算

7.4.1    标准曲线

7.4.1.1  ΔA_400nm标准样 = A_400nm标准样 - A_400nm标准空白样

7.4.1.2  绘制ΔA_400nm相对磷酸μmol量的标准曲线。

7.4.2    样品测定

7.4.2.1    ΔA_400nm试样 = A_400nm试样 - A_400nm空白试样

7.4.2.2 使用标准曲线测定释放磷酸的μmol量。

式中：
    df = 稀释因子
    30 = 每定义单位的检测时间（分钟）
    0.025 = 所用酶的容积(ml)

9审批

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