蓝白斑筛选和菌落筛选实验方案

• 将上述所有组分加入到干净的反应管中。
• 在25°C下孵育30分钟（可在热循环仪中进行）。
• 使用PCR纯化柱纯化DNA，并以约50 μL洗脱。
• 将0.1-10 ng的连接产物转化为与载体相容的化学或电感受态细胞。

转化

高质量的质粒对转化过程至关重要。以下是Sigma-Aldrich提供的用于分离和纯化适合转化的高质量质粒的试剂盒。

关于化学或电感受态细胞转化的详细实验方案，请参见此处。

筛选

Sigma-Aldrich提供一系列有助于筛选重组细菌的生色底物。一些产品可用于在LB琼脂板上铺展（筛选实验方案1），另一些产品则可掺入微生物培养基中（筛选实验方案2）。产品在需要时与IPTG一起使用。这两个实验方案的详细步骤如下。

筛选实验方案1（适用于产品编号B6650、16658、B2904、B3928、16669、B8931）

• 使用无菌涂布器在LB琼脂板上涂布40 μL或适量的生色底物和10 μL IPTG溶液的原液（当使用产品编号B3928时不需添加IPTG，因为它已经含有IPTG）。
• 琼脂板应包括含有适当抗生素和不含抗生素的对照。
• 将板置于层流室中干燥，盖子略微打开。
• 使用无菌涂布器将10-100 μL已转化的大肠杆菌细胞涂布到LB琼脂板上。
• 将板在37°C孵育24-48小时。
• 琼脂表面出现蓝色和白色菌落。选择白色菌落中的重组细胞进​​行培养。

筛选实验方案2（适用于产品编号S7313、S9811、C4478）

• 制备LB琼脂：称重适量粉末培养基、琼脂和水，将其添加到无菌瓶中。也可称取适量C4478，添加到有水的无菌瓶中。
• 高温高压灭菌之前，将300 mg/L产品编号S7313和S9811以及500 mg/L柠檬酸铁铵（产品编号F5879）添加到培养基中。如果使用C4478，则省却该步骤。
• 将培养基高温高压灭菌，并冷却至瓶子刚好不烫手的温度。
• 向培养基中加入适当浓度的选定抗生素。
• 将约25-30 mL的LB琼脂倒入无菌板让其凝固，期间使盖子稍微打开。
• 使用无菌涂布器将10-100 μL已转化的大肠杆菌细胞涂布到LB琼脂板上。
• 将板在37°C孵育24-48小时。
• 琼脂表面出现蓝色和白色菌落。选择白色菌落中的重组细胞进​​行培养。

蓝白斑筛选的局限性

• 蓝白斑技术只是一种筛选程序，不是一种选择技术。
• 载体中的lacZ基因有时可能不起作用而无法产生β-半乳糖苷酶。得到的菌落不是重组的，但仍呈现白色。
• 即使有小序列的外源DNA插入到MCS中并改变lacZ基因的读码框。这导致假阳性白色菌落。
• lacZ的读码框内的小插入物可能产生模糊的浅蓝色菌落，因为β-半乳糖苷酶仅部分失活。