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主页成像分析和活细胞成像方案指导:使用PKH亲脂性膜染料标记外泌体

方案指导:使用PKH亲脂性膜染料标记外泌体

外泌体是存在于大多数体液(包括血液和尿液,以及细胞培养基)中的微型细胞外囊泡,这些带有脂质的微囊泡的大小在30至100 nm之间。由于外泌体通常含有来源于其起源细胞的关键生物分子,如蛋白质和核酸(DNA和RNA),因此外泌体有潜力成为癌症治疗靶标。最近的研究支持外泌体参与细胞间通讯、信号传导、免疫反应以及细胞废物管理。

PKH和CellVue®荧光细胞连接子试剂盒可提供长时间的活细胞荧光膜标记,且无明显毒性作用。这些细胞连接子利用选择性分配,将脂肪族报告分子掺入细胞膜的脂质双层中。膜染料PKH67是一种绿色荧光染料,其激发(490 nm)和发射(504 nm)波长与荧光素和FITC相近。PKH26是红色光谱中的荧光染料,其峰值激发(551 nm)和发射(567 nm)波长特性与罗丹明或藻红蛋白(PE)检测通道兼容,并且也可以被488 nm激光激发。CellVue® Claret是一种远红外荧光染料,不受生理范围内的pH值的影响,并且其激发(655 nm)和发射(675 nm)波长特性与远红外激光兼容。

PKH染料已成功用于体外和体内跟踪实验中标记外泌体和细胞外囊泡。下述外泌体标记方案详细介绍了在微囊泡追踪实验中使用PKH染料实现可靠的外泌体荧光标记的步骤。

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外泌体标记方案

  1. 从利用超速离心或微滤法制备的新鲜分离的外泌体沉淀物开始。外泌体分离方案
  2. 将超速离心机冷却至2-8°C。
  3. 对于每个样品,将来自多个试管的沉淀合并到一个试管中,并测量总体积。
  4. 对于每个样品,使用来自PKH67(PKH67GLMINI67MIDI67)或PKH26(PKH26GLMINI26MIDI26)试剂盒的稀释剂C将沉淀样品的体积定容至1mL。
  5. 确定体积最大的沉淀样品,并取等体积的不含外泌体的培养基添加到新的超速离心管中。  稀释剂C将体积定容1mL。
  6. 将6uL PKH67或PKH26染料添加到步骤4-5的每个含1mL稀释剂C的试管中。
  7. 利用移液器轻轻吹打,连续混合30秒。在室温下静置5分钟。
  8. 加入2mL溶剂为PBS(D8537)的10%BSA(A9418)进行淬灭。使用无血清培养基将体积定容至8.5 mL。
  9. 制备0.971 M的蔗糖溶液(S1888)。
  10. 使用移液管缓慢、小心地将1.5mL蔗糖溶液加入到试管底部,确保不产生涡流。外泌体-PKH67溶液将保留在蔗糖垫层的顶部。
  11. 在2-8°C下以190,000 G离心2小时。
    注:外泌体将位于沉淀中,大多数多余的染料应位于交界层中。
  12. 小心吸出培养基和交界层。
  13. 使用移液器轻轻吹打,将外泌体沉淀重悬于1X PBS(D8537) 中。
  14. 转移至10 kDa MWCO(截留分子量)的Amicon过滤柱中。加入9mL PBS,0.75 mL培养基。
  15. 在高速离心机中以3000 x g的转速离心40分钟,然后根据需要进行多次短暂离心,以将体积减少至0.5-1 mL。
  16. 从Amicon柱中回收浓缩液,将其保存在微量离心管中并至于冰上。尽快使用标记的外泌体,以确保最高的荧光强度。

使用Amnis®成像流式细胞仪分析标记的外泌体

外泌体的细胞摄取

图1。外泌体的细胞摄取。分离来自SW780细胞的外泌体并用PKH26标记。将标记的外泌体与SW780培养17小时后,使用Amnis®ImageStream流式细胞仪进行分析。PKH26亮点出现在含负载外泌体的细胞中,而对照细胞无亮点。

外泌体的内化

图2。外泌体的内化。在SW780细胞摄取PKH26标记的外泌体后,使用表面标记物CAR(柯萨奇病毒-腺病毒受体)对细胞染色,然后使用Amnis® ImageStream流式细胞仪进行分析。重叠图像表明外泌体已被内化。

外泌体的储存稳定性

图3。外泌体的储存稳定性。分离外泌体并用PKH26染色。将PKH26标记的外泌体立即添加到SW780培养物中,或在2-8 °C或-20 °C下储存过夜。在储存过夜后,将外泌体添加到SW780培养物中并使用Amnis® ImageStream流式细胞仪进行分析。将所有样品培养4小时,然后测量摄取。在使用储存外泌体的培养物中可以检测到外泌体摄取,但是可能会观察到荧光强度有一些损失。

外泌体摄取特异性

图4。外泌体摄取特异性。将SW780细胞与PKH标记的外泌体一起培养,然后收集并分析。用胰蛋白酶处理样品,以确定其是否会将外泌体洗脱。将一份培养物样品在2-8 °C下培养,并在另一份培养物中添加叠氮化钠。外泌体检测对胰蛋白酶具有抗性。但是,在2-8 °C培养物或叠氮化钠处理的培养物中均不存在外泌体摄取。

订购表

数据由芝加哥洛约拉大学流式细胞术核心设施核心设施管理人Patricia Simms提供

CellVue®是PTI Research公司的注册商标

Amnis®、FlowSight®、ImageStream®、Guava®和Muse®是默克公司(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)的注册商标

Duolink®是Sigma-Aldrich公司的注册商标

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