两者都对细胞培养具有潜在危害。外毒素是有毒物质,通常是蛋白质,由细菌分泌并释放到细胞外。而内毒素是由位于细菌细胞壁内的脂质组成的细菌毒素。外毒素通常被热破坏,而内毒素不能被高温破坏。外毒素具有高抗原性并引发免疫反应,而内毒素则没有。
鲎变形细胞裂解物测定(LAL测定)是最常用的内毒素检测手段。LAL(来自马蹄蟹)与细菌内毒素脂多糖(LPS)反应,反应后形成可定量的凝胶凝块——LPS是革兰氏阴性细菌的膜组分。内毒素的量以每毫升内毒素单位(EU/mL)表示。一个EU相当于约0.1至0.2 ng内毒素/mL溶液。目前有三种形式的LAL测定,每种形式具有不同的敏感性。LAL凝胶凝块测定可检测低至0.03 EU/mL,而LAL动态浊度法和显色测定法则可检测低至0.01 EU/mL。
Figure 2.LAL assay test principle. The cascade of endotoxin detection in Limulus amoebocyte lysate (LAL) assay starts when the endotoxin LPS reacts with Factor C in and turn, activates the factor B. Factor B turns the gel-forming pro-enzyme into an enzyme. The resulting clotting enzyme is responsible for anchoring the two peptide units in the coagulogen, forming an insoluble gel. Other compounds which also cause the gelation in the amebocyte lysate of the horseshoe crab can interference in the test of bacterial endotoxins. Some of these compounds are (1,3)-β-D-glucans, which lead to false positives in the LAL test.
所有实验室器皿、培养基原料、以及适当的实验室技术的彻底清洁,对于大幅降低细胞培养实验室中的内毒素水平至关重要。另外建议使用过滤装置(例如Stericup®过滤装置)对所有培养基进行过滤除菌,这样可以在加入到细胞之前消除所有潜在的内毒素。
内毒素影响体外和体内细胞生长和功能,并且结果异常的成因。在体外,越来越多的证据表明,内毒素会引起细胞培养研究的各种问题。有记录的影响包括刺激白细胞培养物产生组织因子,在马巨噬细胞中诱导产生IL-6,极低水平(小于1 ng/mL)的内毒素即可抑制鼠红细胞集落形成。在体内,内毒素在动物研究中引发炎症反应。注射用产品(疫苗和注射药物)中内毒素的存在可导致致热反应,包括发烧、发冷、不可逆甚至致命的感染性休克。
鉴于与内毒素污染相关的严重风险,美国食品和药物管理局(FDA)已对研究人员应注意的医疗器械和非肠道药物的内毒素浓度设定了限制。目前的FDA限制要求医疗器械的洗脱液低于0.5 EU/mL,如果医疗器械与脑脊液接触,则限值为0.06 EU/mL。
必须使用来自可靠试剂供应商提供的经内毒素测试的试剂、补剂和培养基。在培养细胞之前,使用适当的无菌技术,并彻底冲洗和消毒所有细胞培养塑料器皿和耗材(例如移液管和锥形管)也很重要。
如果培养物被内毒素污染,建议丢弃所有试剂和细胞,并以新的试剂和细胞开始。但是,如果样品不能丢弃,可以使用试剂来消除内毒素。这些内毒素的去除解决方案借助Triton X-114的胶束特性,从样品中去除LPS内毒素。
如要继续阅读,请登录或创建帐户。
暂无帐户?