谷胱甘肽检测试剂盒

硫醇总量（RSH）的测定：在 356 nm 处检测

Calbiochem 谷胱甘肽检测试剂盒可用于测量其他硫醇（RSH），包括 GSH。该检测在 356nm 处进行（不存在试剂 R2）。356 nm 处的吸光度是样品中[RSH]浓度的线性函数，但不是 GSH 特异性的。如果样品中本来含有 GSH 和另一种硫醇（即 N-乙酰半胱氨酸），则可以通过使用同一样品进行两次测量来测定这两种硫醇。如下所述，在添加试剂 R2 之前在 356nm 处进行第一次测量，并且在添加 R2 之后在 400nm 处进行第二次测量。

仅使用缓冲液（溶液 3）将分光光度计在 356 nm 处的吸光度调整为零。如第 3 节所述方法制备反应混合物，省略步骤 4。在 356 nm 处测量吸光度（A）。

必须使用表 2 中的相应硫醇制备标准曲线来计算浓度。图 2 给出了使用谷胱甘肽和 N 乙酰半胱氨酸在 356 nm 处获得的标准曲线的两个示例。

GSH浓度
根据以下等式计算：
[GSH] = {(A-A₀)/(E x l)} x D
其中：
[GSH]是样品中的初始谷胱甘肽浓度，以摩尔浓度表示。

A和A₀分别是在样品存在和不存在时测量的吸光度。

E是在 400 nm 处测量的产物表观摩尔消光系数。

l是光径(cm)。

D是样品的稀释系数。

总硫醇浓度
根据GSH等式变形计算：
[total RSH] = { (A - A₀) / (E x I) } x D
其中：
[total RSH]是样品中的总硫醇浓度。

A和A₀分别是在样品存在和不存在时测量的吸光度。

E是在 356 nm 处测量的产物表观摩尔消光系数。
I是光径(cm)。

D是样品的稀释系数。

注意：

• 不要以相反的顺序添加试剂 R1 和 R2。
• 在整个实验过程中温度（25 ± 3°C）应保持恒定。
• 最终反应体积（1 ml）不应因测量而改变。
• 400 nm 处的吸光度与谷胱甘肽浓度成正比。只要将反应混合物置于黑暗中，它在分钟内稳定。
• 硫醇在 356 nm 处的测定灵敏度与谷胱甘肽在 400 nm 处的测定灵敏度处于同一数量级，如表 2 所示。

灵敏度：在同一实验条件下，在同一天对对照（[RSH] = 0）进行 30 次重复测量，最终反应混合物（分光光度比色皿）中的检测限为 5 µmol/l。例如，使用最大体积为 300 µl 的样品，谷胱甘肽的检出限因此约为 17 µmol/l。

借助 Calbiochem^® 谷胱甘肽检测试剂盒，仅需一次取样和一次比色测量即可检测谷胱甘肽。该方法的改进可以测定其他硫醇。该替代方案基于替代产品在不存在试剂 R2 的情况下在 356 nm 处吸光度最大的测量。由于该方法简便易行，非常适用于大量生物样品中谷胱甘肽和硫醇总量的定量分析。该方法的主要优点是它不需要任何酶试剂。

毒性：多个毒性值，请参阅 MSDS（O）

试验时间：1.5 h

一种专门用于还原型谷胱甘肽（GSH）或总硫醇的分光光度检测试剂盒。GSH 的吸光度在 〜400 nm 处测定，总巯基的吸光度在 〜356 nm 处测定。

氧化应激发生在大多数（如果不是全部）人类疾病中。我们对活性氧在病理变化过程中所起作用的理解仍在不断发展。一直缺乏方便、准确和可重现的方法来测量氧化应激参数。谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酸甘氨酸或 GSH）是天然存在的三肽，其亲核和还原特性在代谢途径以及大多数需氧细胞的抗氧化系统中起着核心作用。GSH 作为多种酶的辅酶发挥着关键作用，其中包括谷胱甘肽过氧化物酶，谷胱甘肽 S-转移酶和硫醇转移酶。GSH 在药物代谢、钙代谢、γ-谷氨酰胺循环、血小板和膜功能中也起主要作用。此外，谷胱甘肽对各种生命过程至关重要，包括异种生物的解毒、维持蛋白质的 -SH 水平、巯基-二硫键交换、去除氢过氧化物和自由基以及氨基酸跨膜转运。细胞内 GSH 的生理值通常为 1 至 10 mM。尽管已描述了许多测定 GSH 的方法，但可靠的测定方法不仅所需的工作量大且不易使用。

注意：1 T = 1 次测试

Ji, L.L., and Fu, R. 1992.J. Appl. Physiol.72, 549.
Anderson M.E.1989.酶和化学方法测定
谷胱甘肽；在：谷胱甘肽：化学、生化和医学方面, Vol. A, Dolphin D., Poulson R. and Avramovic O. Eds., John Wiley and Sons, pp. 339-365.
Dolphin D., et al. 1989.谷胱甘肽：化学、生化和医学方面, Vols A & B, J. Wiley and Sons.

显色剂，30％ NaOH，缓冲液和说明书。

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红细胞裂解液

1.将至少 500 l 全血在 4°C 下，以 2500 X g 离心 5 分钟。
2.丢弃血浆上清液。如果没有立即进行检测，请将​​红细胞沉淀物储存于 -70°C （红细胞沉淀物可以在 -70°C 下保存 15 天）。
3.将红细胞沉淀重悬于 4 倍体积的 MPA 工作溶液中（0-4°C）。
4.彻底混合并在 4°C 下，以 3000g 离心 10 分钟。
5.收集上层澄清水层，并保持在 0-4°C 进行测定（1 小时内）。

肝匀浆液

1.用 0.9％ NaCl 溶液洗涤组织。
2.用纸巾吸干并称重。
3.在冰冷的 MPA 工作溶液中切碎组织。
4.匀浆切碎的组织。
5.将组织匀浆在 4°C 下，以3000 x g 离心 10 分钟。
6.收集上层澄清水层*，并保持在 0-4°C 进行测定（1 小时内）。
*混浊上清应用0.2 µm滤膜过滤。

肝细胞裂解液

1.将大鼠或小鼠的肝细胞*沉淀重悬于 500 l 冰冷的 MPA 工作溶液中。
2.匀浆细胞悬浮液。
3.将组织匀浆在 4°C 下，以3000 x g 离心 10 分钟。
4.收集上层澄清水层，并保持在 0-4°C 进行测定（1 小时内）。
*使用约 2.5-3.5 x 10⁶ 个细胞（5-8 mg 总蛋白）。

自收到之日起，将试剂盒的所有组件储存于 4°C。

•试剂和缓冲液的所有溶液均已密封，如果在 4°C 下正确储存，则是稳定的。不得冷冻。避光保存。

•取出所需数量的每种试剂后应立即使用，并将所有瓶盖密封并保存在 2-4°C 之间。请勿将试剂瓶处于打开状态或置于室温下。

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