氧化一氮检测试剂盒，荧光法

用于快速定量检测一氧化氮（NO）的检测试剂盒。与比色一氧化氮测定试剂盒（货号 482650）相比，灵敏度提高了 50 倍。该测定的原理是首先硝酸盐还原酶将硝酸盐转化为亚硝酸盐，然后添加 2,3-二氨基邻萘（DAN）和 NaOH，后者将亚硝酸盐转化为荧光化合物。对该化合物的荧光检测可准确测定亚硝酸盐（NO₂^-）的浓度（最大激发波长：365 nm；最大发射波长：450 nm)。请勿与含硝酸盐或亚硝酸盐的组织培养基（例如 RPMI）一起使用。

试验时间：3-5 h

1.培养基：诸如 RPMI 1640 之类的培养基可能含有高水平的硝酸盐。最好不要使用这些类培养基，尤其是在测量硝酸盐含量的微小变化时。如果一定需要使用这类培养基，则可以通过从总含量中减去培养基中（没有细胞的情况下）硝酸盐/亚硝酸盐的含量来定量测定细胞中硝酸盐/亚硝酸盐的含量。添加到培养基中的酚红和胎牛血清（FBS）会导致荧光显着降低。尽可能避免使用这些组分。培养基组分对荧光强度的影响必须通过在等量的酚红或 FBS 存在下绘制硝酸盐或亚硝酸盐标准曲线来评估。为了获得最大的信号响应，最好使用 10 或 20 µl 的样品量。使用大样品量（最终反应体积的 30％ 至 50％）会导致荧光猝灭。要在存在培养基的情况下制备标准曲线，只需用所需的培养基代替检测缓冲液准备硝酸盐或亚硝酸盐标准曲线即可。要测量硝酸盐和亚硝酸盐，反应需要孵育 1 h 才能完成。2。血浆或血清：使用可在市场上买到的离心机或微离心机超滤装置，使血浆或血清样品通过 10 或 30 kDa 截止过滤器。该步骤去除了血红蛋白，从而避免了荧光强度的降低。最多使用 10 µl 滤液测定硝酸盐和/或亚硝酸盐。硝酸盐到亚硝酸盐的转化需要 1-2 小时（对于 ≥95％ 的转化）3.组织匀浆：在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中匀浆样品，并以 10,000 x g 离心 20 分钟。以 100,000 x g 离心 30 分钟（第二次离心是可选的，但会提高过滤速率）。通过 10 或 30 kDa 截止过滤器对上清液进行超滤。使用 10 µl 滤液进行硝酸盐和/或亚硝酸盐测定。硝酸盐向亚硝酸盐的转化需要约 2 小时才能达到 ≥95％ 的转化率。

1.检测缓冲液：用 HPLC 级水将小瓶中的内容物稀释至 100ml。在测定之前，根据需要使用该缓冲液稀释样品。储存于 4°C。该缓冲液在 4°C 下可稳定保存约 2 个月。2.硝酸还原酶：用 1.2 ml 检测缓冲液重悬小瓶的内容物。使用期间请保持在冰上。分装并储存于 -20°C。只允许冻结和解冻该溶液一次。3.酶辅因子：用 1.2 ml 检测缓冲液重悬该小瓶的内容物。使用期间请保持在冰上。分装并储存于 -20°C。只允许冻结和解冻该溶液一次。4.硝酸盐标准品：缓慢取下小瓶塞，最大程度减少对冻干粉的干扰。使用 1.0 ml 的检测缓冲液重悬冻干的硝酸盐标准品。该溶液的浓度为 2mM。旋转小瓶，确保粘附在小瓶侧面的粉末溶解。轻轻涡旋。将所有储备溶液存储于 4°C；重悬后不要冻结。在这些条件下储存时，硝酸盐标准品可稳定保存至少三个月。5。亚硝酸盐标准品：缓慢取下小瓶塞，最大程度减少对冻干粉的干扰。使用 1 ml 的检测缓冲液重悬冻干的亚硝酸盐标准品。该溶液的浓度为 2mM。旋转小瓶，确保粘附在小瓶侧面的粉末溶解。轻轻涡旋。将所有储备溶液存储于 4°C；重悬后不要冻结。在这些条件下储存时，亚硝酸盐标准品可稳定保存至少三个月。6。荧光试剂（DAN）：即用型。储存于 4°C。请勿在该小瓶中加水或检测缓冲液。7.NaOH：即用型。储存于 4°C。请勿在该小瓶中加水或检测缓冲液。

自收到之日起，将试剂盒的所有组件储存于 -20°C 直到使用。有关初始解冻和重悬后各个组件的存储信息，请查阅“分析前准备”部分。

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Misko, T.P., et al. 1993.Anal.Biochem.214, 11.
Green, L.C., et al. 1982.Anal.Biochem.126, 131.

检测缓冲液，硝酸还原酶，酶辅因子，硝酸标准液，亚硝酸盐标准液，DAN 试剂，NaOH，微量滴定板，板盖和说明书。

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毒性：多个毒性值，请参阅 MSDS（O）