MTT是一种淡黄底物，可被活细胞裂解产生深蓝色甲臜产物。这个过程需要活跃的线粒体，即使是新死亡的细胞也不会裂解大量的MTT。下文所述的比色测定法可用于增殖或补体介导的细胞毒性测定。

程序：
1）使用标准方法，在光学质量良好的96孔平底组织培养板中进行淋巴因子、有丝分裂原或补体介导的细胞毒性试验（例如Falcon）。每孔中组织培养基的最终体积应为0.1 mL，培养基（例如RPMI或DMEM）可能含有高达10%的胎牛血清。

2）在试验结束时，向每个孔中加入0.01 mL AB溶液（MTT）。轻轻敲击托盘侧面进行混合。

3）在37°C下孵育，使MTT发生裂解。最佳时间可能因含量测定而异，但4小时适用于大多数目的。在这个时间结束时，在含有活细胞的孔中产生的MTT甲臜会在孔底部显示为黑色的、模糊晶体。

4）向每个孔中加入含0.04 N HCl的0.1 mL异丙醇。用多通道移液器反复移液，充分混匀。HCl将组织培养基中的酚红转化为不干扰MTT甲臜测量的黄色。异丙醇溶解甲臜，得到适合吸光度测量的均匀蓝色溶液。

5）一小时内，在ELISA酶标仪上测定吸光度，测试波长为570 nm，参考波长为630 nm。在室温下放置数小时后，血清蛋白可能会由于酸/酒精而开始沉淀。冷却盘子会加速沉淀。如果测定前必须储存平板，在加入酸/酒精前保持在4°C，然后在读数前加热至室温并加入酸/酒精。

结果：
MTT测定法通常可检测典型细胞系的200至50,000个细胞，尽管1,000至50,000是有用的范围。对于其他细胞类型，此数字可能会有所不同。应建立细胞毒性测定，以使对照，未裂解的细胞的信号为0.2至0.4，并且增殖测定应在平台浓度下产生相似的值。对于典型的细胞系，这相当于每孔约20-50,000个细胞。

吸光度与细胞数成正比；即使浓度高达1 x 10⁶个细胞/mL，实际细胞也不会显著吸收。

可在2-8°C保存长达6个月。试剂A/溶液B混合物在2-8°C下可稳定储存长达两周。

试剂制备：
将10 mL溶液B加入一瓶试剂A中。混匀，无菌过滤，并在4°C下避光保存直至使用。注意：可能需要一夜才能溶解。请勿加热溶液。当绝对需要溶解晶体时，用1-2滴HCl调节pH值。在这些条件下，AB混合物可稳定数周。

试剂A： MTT，（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑），50 mg/瓶。

溶液 B： PBS pH 7.4，15 mL

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