ApopTag 红色原位凋亡检测试剂盒

ApopTag Red原位细胞凋亡检测试剂盒利用抗地高辛抗体和罗丹明荧光染料，通过间接TUNEL法检测原位细胞凋亡。该试剂盒为40个样品提供间接免疫荧光染色。使用荧光显微镜或流式细胞仪分析结果（需要特殊的激光和罗丹明过滤器）。

间接ApopTag试剂盒（S7100、S7101、S7110、S7111和S7165）经鉴定可用于以下标本的组织化学和细胞化学染色：福尔马林固定、石蜡包埋的组织、低温恒温器切片、细胞悬液、细胞离心涂片和细胞培养物。已经开发了整个固定方法（34，45）。

ApopTag过氧化物酶试剂盒染色特异性已由Chemicon和许多其他实验室证明。Chemicon已经测试了多种类型的模型细胞和组织系统，包括：（a）人前列腺，胸腺和大肠（内部数据）；（b）去势后大鼠腹侧前列腺（21），（c）用地塞米松体外处理的大鼠胸腺淋巴细胞（3，13），（d）14天小鼠胚胎肢体（1）和（e）大鼠乳腺断奶后退化（36）。在胸腺细胞和前列腺模型中，琼脂糖凝胶电泳用于评估DNA梯形的数量，该梯形的峰值与染色细胞的最大百分比一致。来自全球实验室的许多期刊出版物已经确定了ApopTag试剂盒的有用性。（见章节V.参考文献，引用ApopTag试剂盒的出版物）。

ApopTag荧光素和罗丹明试剂盒已在以下模型系统中进行了特异性染色测试：（a）在细胞离心涂片中染色的地塞米松诱导的人正常外周血淋巴细胞，（b）在福尔马林固定，石蜡包埋的切片中染色的大鼠乳腺退化，以及（c）在细胞悬液中染色的喜树碱诱导的人白血病外周血淋巴细胞，并用于定量流式细胞仪（22）。

在某些情况下，某些组织含有结合任何荧光素标记核苷酸的细胞类型，例如ApopTag荧光素直接试剂盒（S7160）中包含的细胞类型。因此，建议使用该试剂盒（S7160）对细胞悬液、细胞离心涂片和细胞培养物进行染色，但不能对组织切片进行染色。Chemicon建议使用ApopTag荧光素试剂盒（S7110，S7111）或ApopTag Red试剂盒对组织切片进行染色。参考文件见数据表。

说明

ApopTag原位凋亡检测试剂盒通过利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）修饰基因组DNA来标记研究样品中的凋亡细胞，从而通过特异性染色检测阳性细胞。
本手册包含ApopTag Red细胞凋亡检测试剂盒（S7165）的信息和方案。

程序原理

所有ApopTag试剂盒中提供的试剂旨在用化学标记和未标记的核苷酸原位标记游离的3′OH DNA末端。反应缓冲液中包含的核苷酸通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）酶促添加到DNA中（13，31）。TdT催化不依赖模板的核苷酸三磷酸添加到双链或单链DNA的3′-OH末端。掺入的核苷酸以随机序列形成由地高辛或荧光素核苷酸和未标记的核苷酸组成的低聚物。优化ApopTag 试剂盒中标记核苷酸与未标记核苷酸的比例，以促进抗地高辛配基抗体的结合，或最大程度地减少荧光素的自猝灭。尚未测量添加的低聚物的确切长度。ApopTag系统与先前描述的凋亡原位标记技术（13、16、38、46）显著不同，在该技术中，抗生物素蛋白与细胞生物素的结合可能是错误的来源。已发现地高辛/抗地高辛系统对抗生物素蛋白/生物素系统同样敏感（22）。地高辛的唯一天然来源是洋地黄植物。用于结合抗地高辛抗体的免疫化学相似配体在动物组织中通常是微不足道的，从而确保了低背景染色。亲和纯化的绵羊多克隆抗体是ApopTag试剂盒中使用的特异性抗地高辛试剂。该抗体与主要脊椎动物类固醇表现出<1%的交叉反应性。此外，该抗体的Fc部分已通过蛋白水解消化去除，以消除对细胞Fc受体的任何非特异性吸附。

使用ApopTag试剂盒的结果已广泛发表（请参阅章节V.参考文献，引用ApopTag试剂盒的出版物）。ApopTag产品线在实验设计中提供了各种选择。研究人员可以根据可用的专业知识和设备选择通过明场或荧光显微镜或流式细胞仪检测染色。当使用ApopTag试剂盒时，也有机会在细胞凋亡的背景下研究其他相关的蛋白质。通过使用与过氧化物酶以外的酶偶联的抗体和适当的底物选择，可以使用ApopTag过氧化物酶试剂盒同时检查另一种蛋白质和细胞凋亡。还有一种选择使用ApopTag技术的荧光团（荧光素和罗丹明）。在选择抗体-荧光组合以研究其他重要蛋白质时存在灵活性。

ApopTag Red原位细胞凋亡检测试剂盒利用抗地高辛抗体和罗丹明荧光染料，通过间接TUNEL法检测原位细胞凋亡。

1.将试剂盒储存在-15℃至-25℃下，直至首次使用。首次使用后，如果试剂盒将在三个月内使用，则将TdT酶（90418）储存在-15℃至-25℃，其余组分储存在2℃至8℃。

2.保护抗地高辛罗丹明抗体（90429）避免不必要的光暴露。

注意事项

1.以下试剂盒组件包含二甲胂酸钾（二甲基胂酸）作为缓冲液：平衡缓冲液（90416），反应缓冲液（90417）和TdT酶（90418）。如果吞食，这些成分是有害的；避免接触皮肤和眼睛（戴上手套，眼镜），并立即清洗接触区域。

2.抗体偶联物（90429）和封闭液（90425），含有0.08%叠氮化钠作为防腐剂。

3.TdT酶（90418）含有甘油，在-20℃时不会结冰。对于最长有效期，请勿将该试剂在分装前加热至室温。

平衡缓冲液 90416 3.0 mL -15℃至-25℃
反应缓冲液 90417 2.0 mL -15℃至-25℃
TdT酶90418 0.64 mL -15℃至-25℃
终止/清洗缓冲液 90419 20 mL -15℃至-25℃
封闭液 90425 2.6 mL -15℃至-25℃
抗地高辛-罗丹明* 90429 2.1 mL 2℃至8℃
塑料盖玻片 90421 100 ea.室温
*亲和纯化的绵羊多克隆抗体
每个试剂盒的检测次数：当根据说明使用时，提供足够的材料对40个约5 cm2的组织标本进行染色。当试剂盒用于载玻片标本时，反应缓冲液将在其他试剂之前完全消耗。

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