如何在 AAW™ 工作站上自动进行 Duolink^® 检测

本规程详细介绍了如何使用 AAW™ 自动测试工作站自动进行 Duolink^® assay 分析。这些 96 孔微孔板可提高走行时间和高通量能力。查看以下详细信息和数据。

自动化和 Duolink^®所需材料

实验室用具

• Opentrons^®200微升吸头架，过滤型（Prod.No.99100105）
  • （第 1 天：1 盒，第 2 天：3 或 4 盒）
  • （第 1 天：1 盒，第 2 天：3 或 4 盒3 or 4 boxes)
• Opentrons^® 1,000 μL tip rack, filtered (Prod.99100106）
  • （第 1 天：1 盒，第 2 天：2 盒）
• NEST深孔96孔板（Opentrons^® Prod.99900103)
• NEST 12 孔储液器（Opentrons^® Prod.99900076)
• NEST 290 mL 1 孔贮液槽 (Opentrons^® Prod. No. 99900207)
• 分析板：方形孔（Ibidi^® Prod.建议使用 89626 或 89627 号）或圆孔（康宁^® 产品编号：CLS3603 或类似型号）

Hardware

• AAW™ Automated Assay Workstation (Prod. No. 99900241)
• AAW™ 8-Channel Pipette, 1, 000 μL (Prod. No.99900245)
• AAW™ 1-Channel Pipette, 1,000 μL (Prod.No. 99900246)
• AAW™ Flex Gripper (Prod.99900244)
• Opentrons Flex™ Heater-Shaker (Get A Quote）
• Opentrons Flex™ 甲板扩展器（4 个）（产品型号 99900203）
• 可选：Opentrons Flex™ 温度模块 (Get A Quote)

试剂

• Duolink^®阻断溶液（Prod.DUO82007）
• 靶蛋白特异性一抗
  • 对照试剂盒使用小鼠抗 EGFR 抗体（Prod.E3138）和兔抗 ErbB2/HER2 抗体（Prod.HPA001383）
• Duolink^®聚乳酸探针（5x）（一个PLUS和一个MINUS，来自不同物种，与一抗的宿主物种匹配）
  • Prod.DUO92002 和 Prod.DUO92004或类似产品
• 抗体稀释液（Prod.编号DUO82008）- 用于稀释聚乳酸探针，必要时稀释一抗
• 连接储备液（5x）- 用高纯度水稀释。用高纯水稀释，如Milli-Q^®实验室用水系统，制成 1x 连接缓冲液（Prod.DUO92008或类似产品）
• 连接酶（1 U/μL，40x）--在连接缓冲液中稀释至 1x，制成连接液（Prod.DUO92008或类似产品）
• 扩增储备液（绿色、橙色、红色和远红）（5x）（Prod.编号DUO92008 或类似产品） - 用高纯水稀释，制成 1x 扩增缓冲液
  • 注意：以下数据使用的是红色检测试剂
• 聚合酶（10 U/μL，80x）--在扩增缓冲液中稀释至 1x，制成扩增液（Prod.DUO92008或类似产品）
• 洗涤缓冲液A和B（Prod.DUO82049）
  • 应在化验开始前将一小袋的内容物溶解在高纯度水中，最终体积为 1,000 mL。溶液可在室温下短期储存（少于两周）或在 4 °C 下长期储存。
• 0.01x洗涤缓冲液B
  • 应在检测开始前用高纯水以1:100稀释1x洗涤缓冲液B。DUO82064)- 在高纯度水中稀释至 1 倍
  • 防褪色（10 倍）（产品编号：DUO82064）。DUO82064)- 用高纯度水稀释至 1 倍
• 防褪色 (10x) (Pro No.

Duolink^®协议协议上传

从 Millipore^®协议库并上传到Opentrons^®应用程序。目前可用的方案允许选择1) Duolink^®组件测试方案来测试抗体浓度或阳性/阴性对照，或2) Duolink^®多孔板检测方案，允许客户使用单个选定的抗体对组合和浓度运行多达96个样品。每个方案都有方形或圆形 96 孔方案版本。

1. Duolink^®成分测试化验第1天
2. Duolink
3. Duolink^® 多孔板第 1 天
4. Duolink^® 多孔板  第 2 天

AAW™ 工作站设置

AAW™工作站用于自动进行 Duolink^® PLA 检测。检测方案被改编成 Python 代码，并导入到工作站上的 Opentrons^® 应用程序中。仪器执行所有液体处理步骤、孵育和振荡步骤。如果选择了温度模块选项，则所有化验步骤均可省去。如果没有选择，则需要 3 个简短的人工干预步骤，以便根据需要将对温度敏感的试剂添加到甲板上。

为 Duolink^® Assay 准备仪器

1. 从 Millipore^®协议库中下载所选的Duolink^®协议文件，并如上所述将其加载到计算机上的Opentrons^®应用程序中。然后通过 "发送到 Opentrons FLEX "或"开始设置"功能将协议发送到 AAW™ 工作站。
2. 确保根据 AAW™ 用户手册将适当的模块、夹具和移液器装入适当的位置并进行校准。
3. 一旦协议发送到机器人，就可以通过选择协议和"开始设置"按钮启动检测。此时将显示参数列表，可选择具体的检测参数。操作员可以选择更改，但默认选择如下：

第 1 天

1. 样品数：1-96
   1. 注意：仅当选择了全平板方案时
2. 干运行：开或关（默认），用于缩短孵育和清洗步骤的练习运行
3. 甲板上孵育：开（默认），关 
4. 使用平板盖：开（默认），关可选择让 AAW™ Flex 夹持器盖上平板盖（开）或用户手动盖上平板盖（关）

第 2 天

1. 样品数：1-96
2. 干运行：开或关（默认），用作缩短孵育和洗涤步骤的练习运行
3. 甲板上孵育：开（默认），关
4. 使用培养皿盖：开（默认），关可选择让 AAW™ Flex 夹持器盖上平板盖（开）或让用户手动盖上平板盖（关）
5. 使用温度模块：开（默认），关可选择第 2 天完全走纸。如果不使用，则需要 3 个简短的人工干预步骤，以便根据需要将对温度敏感的试剂添加到平板上。

4. 在开始运行之前，必须按照触摸屏上或 Opentrons^® 应用程序中的逐步说明，至少进行一次实验室器皿位置检查。一旦确认了实验室器皿偏置，AAW™ 工作站就会存储这些值，供以后运行时使用，除非需要，否则无需重复。实验室器皿位置检查可在干运行时使用空的实验室器皿，也可使用试剂就绪的实验室器皿。根据是否选择温度模块，确保使用正确的实验器皿位置偏移。

Duolink^{化验设置®} 检测设置步骤

Duolink^® PLA 按照 多孔板产品说明书手动操作，并在 AAW™ 工作站上使用调整后的方案（见下文）。检测的所有步骤均在仪器平台上进行。如果选择了温度模块，则第 2 天无需人工干预步骤。如果没有选择，则会在方案中设置暂停，以添加对温度敏感的连接酶和聚合酶/扩增溶液。如上所述，每个方案都有方形或圆形 96 孔方案版本。在方形孔中运行的检测需要每孔 80 µL 的试剂量，在圆形孔中运行的检测需要每孔 40 µL 的试剂量。100RXN Duolink^® 试剂盒的试剂量足以满足圆形孔的试剂量要求，但在方形孔中可能需要购买额外的试剂以满足 80 µL 孔的试剂量要求。

运行前的准备

1. 在多孔板中培养细胞，然后按照标准免疫染色方案处理（饥饿、刺激等）、清洗和固定细胞。一抗的条件应在样品固定、抗原回收、封闭液、抗体稀释液、浓度、孵育温度和时间等方面进行优化。
   1. 在 EGFR/HER2 应用中，SK-OV3 细胞在多孔板（方孔和圆孔）中培养，用 EGF 刺激，并按照 的产品信息表中的说明进行固定。Duolink^®对照试剂盒和多孔板方案的产品信息表中的说明进行固定。
2. 在 AAW™ 工作站上运行 Duolink^® 程序之前，细胞必须透化 10 分钟（0.2% Triton X-100（Prod.T8787）在 1´ PBS（Prod.
3. 在 PBS 中清洗细胞两次，每次 2 分钟，轻轻摇动，最后在进行检测前立即清除平板上多余的 PBS。

第 1 天

试剂准备

请按照Duolink^® PLA 荧光方案进行第 1 天试剂准备。

1. 为 Duolink^® 成分测试测定或 Duolink^® 多孔板测定准备一抗稀释液。Duolink^® 成分检测试剂盒可用于确定阳性/阴性对照抗体组合或检测不同的抗体浓度。
   
2. 
   
   1. 对于表皮生长因子受体/HER2 Duolink^®成分检测试剂盒，一抗（小鼠抗EGFR（Prod.E3138）和兔抗 ErbB2/HER2 (Prod. No. E3138)。HPA001383）在 Duolink^® PLA 抗体稀释液（Prod.DUO82008）分别稀释至 1:100 和 1:5,000 的最终浓度。测试的抗体条件为阴性对照 -EGFR/-HER2、+HER2/-EGFR、-HER2/+EGFR 和阳性对照 +HER2/+EGFR。
   2. 对于96样本EGFR/HER2 Duolink^®多孔板检测，一抗（小鼠抗EGFR抗体和兔抗ErbB2/ HER2）在Duolink^® PLA抗体稀释液（Prod.DUO82008）分别稀释至 1:100 和 1:5,000 的最终浓度。运行全板阳性对照+HER2/+EGFR一抗。
3. 根据检测运行类型（成分检测与多孔板）将抗体装入NEST深壁试剂板：将 4 组阳性或阴性对照抗体（或浓度）装入 A1-D1 孔。
4. 对于多孔板检测：
   注意：化验运行类型的化验体积会在化验启动时显示在应用程序或触摸屏上。如果样品数不是 96，请参阅 Opentrons^® 应用程序或触摸屏，了解所需的确切体积。

机器人平台配置和自动测试协议

1. 将所有试剂放入 NEST Deep 96 孔试剂板上的相应孔中后，就可以将实验器皿放在平台上的适当位置，如下文所列，如图 1 和图 2 所示：
   1. 1x 盒 P200 吸头，放在 B2 中
   2. 1x 盒 P1000 吸头，放在 B3 中
   3. NEST 深 96 孔试剂板，放在 C1 中
   4. C2中的样品板
   5. C4中的样品板盖
   6. D2中的NEST 290 mL 储液器

2. 一旦所有实验器皿都放置在正确位置，即可关闭机器人门。从这里开始，可以选择启动设置按钮，选择参数，并按照上文AAW™工作站设置部分所述执行实验器皿位置检查（如果尚未执行）。如果已经激活了启动设置功能并选择了参数，则可以通过选择蓝色的"运行箭头"开始化验。
3. AAW™工作站现在将执行程序。
4. 程序完成后，C2 中的检测板就可以加入一抗，在 4 °C 下进行离台过夜孵育了。

第 2 天

试剂准备

如果使用温度模块，可在检测开始时配制所有溶液，并在整个自动检测过程中保持在 4 °C。

如果不使用温度模块，请在使用前立即配制成分，并在内置程序暂停时按照指示加入试剂孔中。

请按照Duolink^® PLA 荧光协议，用于试剂制备。检测启动时，可在 Opentrons^® 应用程序或 AAW™ 触摸屏中找到容量。

1. 将聚乳酸探针放入试剂深孔板的 A1-H1 孔中。
2. 将准备好的连接酶溶液（1 倍连接酶 + 1 倍连接酶缓冲液）放入深孔试剂板的 A2-H2 孔中。
3. 将准备好的扩增溶液（1 倍聚合酶 + 1 倍扩增缓冲液）放入深孔试剂板的 A3-H3 孔中。
4. 在深孔试剂板 A4-H4 孔中加入 1x DAPI 核染色剂。
5. 在深孔试剂板 A5-H5 孔中加入 1x 抗褪色剂。
6. 洗涤缓冲液
7. 洗涤缓冲液 A
   1. Duolink^®组件测试板：NEST 12 孔贮槽的 1-6 孔
   2. Duolink^® 多孔板：NEST 290 mL 储液器
8. 洗涤缓冲液 B
   1. Duolink^®元件测试板：NEST 12 孔贮水池的第 7-8 孔
   2. Duolink^® 多孔板：NEST 12 孔样品池的 1-4 孔
9. 洗涤缓冲液 0.1x B
   1. Duolink^®元件测试板：
   2. Duolink^® 多孔板：NEST 12 孔储层的第 9 孔
   3. Duolink^® 多孔板：NEST 12 孔样品池的第 5-6 孔
10. PBS
    1. Duolink^®元件测试板：NEST 12 孔储层的第 10 孔
    2. Duolink^® 多孔板：

机器人平台配置和自动测试协议

1. 4x 盒 P200 吸头（A1、A2、B1 和 B2 版），用于 Duolink^® 组份测试测定；或 3x 盒 P200 吸头（A1、A2、B1 版），用于 Duolink^® 组份测试测定。多孔板检测
2. A3 和 B3 中的 2x 盒 P1000 吸头
3. C1 中的 NEST 深 96 孔试剂板（带或不带温度模块）
5. C3中的用于Duolink^®成分测试测定的洗涤缓冲液NEST 12孔储液器
6. 用于Duolink^®多孔试剂盒的NEST 12孔储液器® 多孔板测定，B2 中的洗涤缓冲液 NEST 12 孔贮液器和 C3 中的 NEST 290 mL 贮液器
7. D2中的空 NEST 290 mL 贮液器

2. 如果已激活开始设置功能并选择了参数，则可通过选择蓝色"运行箭头"开始测定。
   1. 如果使用温度模块，则无需人工干预。
   2. 如果不使用温度模块，则会有内置协议暂停，提示用户添加对温度敏感的试剂（连接酶、聚合酶等）。触摸屏将显示下一个暂停步骤的时间，以便您协调并离开。
3. 一旦程序完成，检测板就可以在 C2 中进行荧光成像。

自动 Duolink^®。检测与手动检测结果对比

在方形和圆形多孔板中使用 EGFR-HER2 对照试剂盒试剂对自动 Duolink^® 方案进行了测试。对经 EGF 处理的 SK-OV3 细胞的阴性对照（无 EGFR/HER2 一抗）和阳性对照（两种 EGFR/HER2 抗体）进行了 Duolink^® 成分测试。 使用 Duolink^® 成分测试协议进行 EGFR-HER2 对照试剂盒检测的人工和 AAW™ 工作站荧光图像显示，阴性对照中没有 EGFR-HER2 共定位，阳性对照中存在共定位（点状）（图 5）。这一结果在多次运行和两种平板几何类型中均可重复（图 6）。使用 ImageJ 分析对阳性区域染色百分比进行了半定量评估（图 7）。

AAW™工作站全自动Duolink^®检测仪既可使用Duolink^®成分测试协议进行抗体测试，也可使用Duolink^®多孔板协议进行样品筛选（输入最多96个）。这里，Duolink^® 多孔板方案在经 EGF 处理与未经处理的 SK-OV3 细胞（各 48 孔）上进行了评估。图 8a 中显示了 EGF 处理和未处理的 EGFR-HER2 共定位的代表性荧光图像。根据阳性染色面积百分比对共聚焦进行的半定量评估显示，EGF 处理结果的 EGFR-HER2 相互作用（约 2.5 倍）在统计学上明显更高（图 8b）。

最后，对化验时间和免提工作进行了分析，并对自动化验和手动化验进行了比较。虽然周期时间非常相似，但主要优势在于减少了动手时间。Duolink^®检测第一天大约需要 1.5 小时，第二天需要 5-7 小时。使用自动协议后，95% 的时间无需动手，如果使用温度模块，则 100% 的时间无需动手。

摘要

本文演示了如何利用 Duolink^®

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