如何在 AAW™ 工作站上实现 ELISA 自动化

本文介绍了如何在 AAW^™ 工作站上将我们的 Conferma^® ELISA 以及其他 ELISA 检测实现自动化，并说明了为何“无人值守式”ELISA 自动化有助于提升实验结果的重复性和整体表现。

ELISA自动化简介

实验室自动化（例如 ELISA 自动化）可以在提升效率和一致性的同时，减少人工操作步骤中常见的人为错误。AAW^™ 自动检测工作站是一套由 Opentrons^® 技术驱动的模块化机器人移液与实验自动化系统，专为高通量和技术型实验流程设计，其中也包括免疫分析应用。

我们的ELISA试剂盒主要采用夹心法 ELISA 技术，可准确测定血清、血浆等多种样本中的目标抗原水平。由于这类实验对灵敏度要求较高，移液的准确性和精密性对于获得可靠结果至关重要。

下面内容展示了如何通过在 AAW^™ 工作站上实现 ELISA 流程自动化，提升实验重复性和整体性能。自动化不仅优化了关键实验指标，也减少了人工操作时间和人为误差。该方案已在人血清中的以下可溶性人源生物标志物上完成验证：TNF-α, IL-6, IL-8, MCP-1, Leptin, Insulin, Amylin, Ghrelin (Active/Total), and S100B。

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ELISA自动化所需的材料

以下列出了运行该自动化 ELISA 方案所需的相关 ELISA 试剂盒、实验耗材和硬件设备。

实验耗材

• Opentrons^® Tough 22 mL 12 孔试剂槽（Opentrons^® 货号：999-00260）
• 290 mL 单槽储液槽（Opentrons^® 货号：999-00207）
• NEST 2 mL 96 孔深孔板，V 形底储液板（Opentrons^® 货号：999-00103）
  • 适用于 TNF-α、IL-6、MCP-1、瘦素、阿米林、生长素释放肽和 S100B 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂盒
• 96 孔 V 形底板（货号：AXYP96450VCS）
  • 适用于 Insulin 和 IL-8 ELISA 试剂盒
• Opentrons^® 50 μL 滤芯吸头盒（货号：99100104）
  • 适用于 Ghrelin 和 Insulin ELISA 试剂盒
• Opentrons^® 200 μL 滤芯吸头盒（货号：99100105）
• Opentrons^® 1,000 μL 滤芯吸头盒（货号：99100106）

此外，该方案还使用 Opentrons^® Universal Flat Heater-Shaker Adapter Type B 适配器。购买 Assay-Ready AAW™ Workstation 时，该适配器会随 Heater-Shaker 模块一并提供。

除此之外，如果用户选择在工作站平台外进行洗板，也可以选配 BioTek^® 405^™ TSUVS 洗板机；若需要更便捷地处理废吸头，也可选配 Opentrons Flex^™ Waste Chute 废弃吸头滑槽。

软件

我们的 Belysa^® 免疫分析曲线拟合软件与 ELISA 试剂盒能够很好配套使用，界面友好，便于用户分析实验数据并比较标准曲线。下文展示的数据即使用该软件进行分析。

实验方案上传与AAW™工作站设置

AAW^™ 工作站可用于将原本手工执行的 ELISA 流程实现自动化。新用户应参考 AAW^™ 用户手册，以了解如何将实验方案导入工作站；这里也提供了简要操作指引。

在开始自动化 ELISA 实验前，需要先完成以下准备工作：

1. 若要将程序导入 AAW^™ 工作站，用户首先需要在电脑上安装 Opentrons^® 应用程序，并通过 Wi Fi、以太网或 USB 数据线连接 AAW™ 机器人。
2. 从 Millipore^® 实验方案库下载对应 ELISA 试剂盒的实验方案，并将其上传至电脑中的 Opentrons^® App。之后可通过点击“Send to Opentrons FLEX”或“Start Set-Up”按钮，将方案传输至 AAW^™ 工作站。
3. 按照应用程序或AAW™触摸屏上的列表，装载所需的模块和移液器。将Opentrons Flex^™加热振荡器装入工作台插槽D1。确保该模块已插入电源、已开启，且在应用程序或触摸屏的模块列表中可见。
4. 当机器人成功接收到电脑传输的实验方案后，点击“Start Set-Up”即可开始设置实验。系统会提示用户根据具体实验需求设置以下参数：
   1. Dry Run（空跑）：默认关闭；也可开启用于练习运行。空跑模式会缩短孵育时间，且不消耗试剂和吸头。
   2. Number of Samples（样本数）：输入本次实验要检测的样本数量（例如 TNF-α ELISA 试剂盒支持 0–38 个样本）。不同试剂盒支持的最大样本数不同，请按对应方案说明设置。
   3. P1000 单道移液器位置：可设置在右侧或左侧（默认在右侧）。
   4. Wash Step（洗板方式）：系统提供三种洗板选项：
      1. Wash on Deck（平台内洗板，默认）：由 AAW^™ 工作站在 deck 上完成洗板，可实现连续式无人值守自动化。
      2. Plate Washer（洗板机洗板）：AAW^™ 工作站会暂停，用户需使用自选洗板机完成洗板。
      3. Manual Wash（手工洗板）：AAW^™ 工作站会暂停，用户需手动完成洗板。
   5. Substrate Incubation（底物孵育时间，分钟）：输入底物孵育时间（例如 TNF-α 试剂盒为 5–25 分钟，默认 16 分钟）。
   6. Tip Disposal（废吸头处理方式）：可选择扔入垃圾盒或通过废弃滑槽处理。
   7. Matrix Effect（基质效应）：如果本次运行中的样本含有明显血清基质成分，则选择 Yes（默认）。
      
      • （该运行参数仅适用于 Human Insulin ELISA 试剂盒）。
   8. 建议先进行一次空跑，以熟悉 AAW^™ 工作站上的实验步骤。空跑时可以完全不加液体，也可以使用水或缓冲液。此模式会缩短混匀和孵育时间，并支持将吸头放回吸头盒，方便反复练习。
   9. 在正式运行前，必须至少进行一次 Labware position check（耗材位置校准）。请按照触控屏上的分步说明完成校准。一旦确认耗材偏移值，AAW^™ 工作站会将其保存，后续运行同一方案时通常无需重复调整，除非用户希望重新校准。

   AAW^™ 仪器可完成所有液体处理步骤，包括标准曲线的连续稀释、deck 上振荡混匀以及平台内洗板。整个实验中仅有一个需要人工介入的步骤：去除多余洗液，并将避光保存的底物溶液加入 deck。

   此外，用户也可以选择使用 BioTek^® 405™TSUVS 板洗器在平台外洗板，或直接进行手工洗板。

ELISA实验设置流程

以下是这些 ELISA 方案在样本准备和试剂准备方面的详细说明。

样本准备

• 对于血清样本，采血后应先静置至少 30 分钟使其凝血，再以 1,000×g 离心 10 分钟，随后分离血清。
• 对于血浆样本，应在采血后 30 分钟内，以 1,000×g 离心 10 分钟，随后分离血浆。
• 未使用的样本应保存在 ≤ -20 °C 条件下，并尽量避免经历两次及以上反复冻融。若使用冻存样本，建议在检测前将其完全融化，充分涡旋混匀后再离心，以去除颗粒物。
• 更详细、针对不同试剂盒的说明，请参考相应的实验方案手册。

试剂准备

注意：所有试剂均应按照对应 ELISA 试剂盒各自的说明书进行配制。

1. 所有试剂在使用前都应恢复至室温。
2. 按照实验手册或分析证书中的说明，复溶所有标准品和质控品。
3. 按照实验手册中的说明复溶血清基质。
4. 将 10× 洗液配制成 1× Wash Buffer。
5. 底物在 Post-Enzyme Wash（酶作用后洗板）完成之前都应避光保存。届时工作站会自动暂停，并在触控屏上提示何时加入底物。
6. 按照 图 1 或 AAW™ 工作站触控屏上的示意，将试剂加入 Standard+Sample 板和试剂储液槽中。

• 具体加样体积可在方案载入后，通过工作站触控屏的 Map View 查看。
• 当样本量低于某一数量时（例如 TNF-α 试剂盒中仅检测 14 个样本），只需要一个洗液槽和一个废液槽即可。
• 实验开始时不要提前加入底物。由于底物溶液对光敏感，最佳做法是在真正使用前再加入，以保证实验效果。机器人会在 Post-Enzyme Wash 结束后暂停，并提示用户此时加入底物。

Deck 布局与实验流程

当所有试剂和样本准备完成并加入指定孔位后，请按照 Opentrons^® App 中显示的 deck 布局摆放实验耗材，如 图 2 所示。

1. 在 deck 的 A1、A2 和 B2 位置放置 3 盒 200 µL 吸头。
   i. 对于使用 50 µL 吸头的试剂盒，请将两盒 200 µL 吸头装入托盘位置 A1 和 A2，并将一盒 50 µL 吸头装入托盘位置 B2。
2. 在 A3 位置放置一盒 1,000 µL 吸头。
3. 在 C1 位置放置 Opentrons^® 12 孔试剂槽。
4. 在 B1 位置放置 NEST 2 mL 96 孔样本板或 96 孔 V 底板。
5. 将试剂盒配套的 96 孔 ELISA 检测板安装到 D1 位置的 Heater-Shaker 上，并配合 Universal Flat Type B 适配器使用。
6. 在 C2 和 B3 位置放置装有适量洗液的 290 mL 单槽储液槽。
7. 在 D2 和 C3 位置放置用于收集废液的 290 mL 单槽储液槽。

1. 当所有耗材和试剂都放置到正确位置后，关闭机器人舱门。如果已完成 Start Set-Up 设置并选好运行参数，点击蓝色运行箭头即可启动实验。实验流程如 图 3 所示。
2. 在酶作用后洗板完成后，机器人会暂停并解锁 Heater-Shaker。此时请小心取下检测板，将其倒置并轻拍，以倒出多余洗液，然后再放回 Heater-Shaker。
   1. 为确保后续步骤中信号能最佳显色，必须清除所有残留的洗涤缓冲液。若使用洗板机或手动清洗，请跳过此步骤。
   2. 接着，将适量底物溶液加入 Opentrons^® 12 孔试剂槽中指定的孔位，然后点击“Resume”继续运行实验流程。
      
      1. 为进一步优化流程，在 Conferma^® Human IL-8 ELISA 方案中，还在实验前段、标准品稀释和预润洗步骤之后增加了一次“暂停-轻拍”操作：取下检测板，倒置并轻拍以去除多余洗液，然后再放回 Heater-Shaker。
3. 当方案运行完成后，将检测板从 Heater-Shaker 上取下并放入酶标仪，开始读数。
   1. 对于 Human Amylin ELISA，前期会有一个 22 分钟的初始孵育步骤。孵育结束后，Heater-Shaker 会自动解锁。此时需使用酶标仪读取荧光信号以监测显色/发光进程。如果尚未达到理想信号强度，可将检测板移出 deck，在不振荡的情况下继续孵育，并每隔 2–3 分钟读取一次荧光，以跟踪信号变化。当达到所需的信噪比或荧光强度后，再将检测板放回 Heater-Shaker，并点击“resume”进入方案最后一步。

表1列出了 Millipore^® Protocol Library 中重点展示的多种 ELISA 自动化方案所对应的离岗自动运行时间。

结果与验证：自动化 ELISA 对比手工 ELISA

ELISA 实验分别按照产品说明书以手工方式完成，以及使用适配后的方案在 AAW™ 工作站上完成。自动化流程中的所有实验步骤均在仪器 deck 上执行。所有实验结果均通过 BioTek^® Synergy HTX 多功能酶标仪读取，并使用Belysa^®免疫分析曲线拟合软件进行数据分析。

上述自动化 ELISA 方案已在前文列出的所有 ELISA 试剂盒上完成验证。本节展示的数据来自 5 次在 AAW^™ 工作站上完成的 Conferma^® TNF-α ELISA 实验，其中 2 次包含真实样本检测。下文还包含其他 ELISA 试剂盒得到的数据。

在这 5 次 AAW^™ 工作站运行中，有 4 次达到了文献/产品公布的最低定量下限（LLOQ）1.65 pg/mL，另有 1 次达到 4.94 pg/mL，这一结果与手工实验相当（见 图 4）。

对不同实验运行之间的平行性和相对效价进行评估后，可以看出 AAW™ 仪器具有良好的一致性和可靠性（见 表 2 和 图 5）。

自动化实验（AAW^™ Run 2 至 AAW^™ Run 5）的平行性数值范围为 1.007–1.030，说明该系统在多次运行中的响应稳定且一致。相比之下，手工实验的平行性范围为 0.999–1.014。两者结果高度接近，进一步说明 AAW™ 仪器能够获得与手工实验相似且可靠的结果。

自动化实验的相对效价值介于 0.880–1.197 之间，表明该仪器能够保持稳定可靠的实验表现，而且与手工实验结果具有良好的可比性（手工实验的相对效价范围为 0.954–1.229）。

总体来看，AAW™ 机器人无论在不同运行批次之间，还是与手工实验相比，都表现出稳定一致的性能，体现了其在实验执行中的良好重复性和可靠性。

进一步比较 AAW^™ 自动化实验与手工实验的变异系数（%CV）后，也可以看到自动化方案具有良好的重复性。自动化运行在标准品上的变异与手工实验相近，而在质控品上的变异则明显更低（见 图 6）。

最后，还对人血清和血浆样本进行了 AAW^™ 自动化检测，并在同一天使用相同试剂盒和相同样本同步进行了手工实验。结果显示，两种平行方案之间具有很强的相关性：样本的 R² 值为 0.9825，质控品的 R² 值为 0.9998。这进一步验证了 AAW^™ 工作站能够产生与手工实验高度可比的结果（见 图 7）。