人表皮角质形成细胞（HEK）培养方案

储存
培养的准备工作
培养HEK
传代培养HEK

I. 储存

A. 冻存管 (102-05n, 102-05f, 102-05a)

将细胞放入冻存管后须立即储存在液氮储罐中。

*从液氮储罐中取出冻存管时，请务必戴上面罩和手套。从液氮储罐到房间的剧烈温度变化可以导致冻存管中存留的任何液氮爆裂并造成人员受伤。

II.培养的准备工作。

1. 确保具有HEPA过滤层流的II级生物安全柜处于正常工作状态。
2. 用70％酒精对生物安全柜消毒。
3. 在开始细胞培养工作之前，打开生物安全柜风机10分钟。
4. 确保所有血清移液器、移液器吸头和试剂溶液都是无菌的。
5. 遵循标准灭菌技术和安全规则：
   a.请勿用嘴吸移液。
   b.在处理人体细胞时，请始终戴上手套和护目镜，即使所有菌株都已
   检测HIV、乙型肝炎和丙型肝炎为阴性，亦应有适当保护。
   c.在无菌超净台中进行所有细胞培养工作。

III.培养HEK

A. 为HEK培养准备细胞培养瓶

1. 从冰箱中取出胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)*。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 吸取15 mL胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)**置于T-75培养瓶中。
   * 如果使用306-05a，人表皮角质形成细胞，HEK，成人（106-05a），则对本实验方案的所有步骤使用成人角质形成细胞无血清生长培养基（131-500a）。
   ** 保持培养基与表面积之比为每5 cm² 1 mL。
   例如：
   - 一个T-25培养瓶或一个60 mm组织培养皿使用5 mL培养基。
   - 一个T-75培养瓶或一个100 mm组织培养皿使用15 mL培养基。

B. 解冻和接种HEK

1. 在眼睛和手都有适当保护的情况下，从液氮储罐取出冷冻保存的HEK小管。
2. 将瓶盖转动四分之一圈，以释放可能被困在螺纹中的液氮，然后重新拧紧瓶盖。
3. 将小管的下半部分放在37°C水浴中快速解冻细胞，并在解冻过程中密切观察小管。
4. 当小管中仅有少量冰时，从水浴中取出小管。请勿让细胞完全解冻。
5. 在无菌生物安全柜中用70％酒精对小管外部消毒。
6. 小心取下小管盖。请勿用手触摸盖子或小管的边缘，以免污染。
7. 用2 mL移液管轻轻吹5次，将细胞重悬于小管中。小心不要过于剧烈地移液以免起泡。
8. 用移液管从冻存管中取出细胞悬液（1mL）并轻轻转移至装有15 mL胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)的T-75培养瓶(SIAL0641)中。
9. 盖上培养瓶并轻轻摇动，使细胞均匀分布。
10. 将T-75培养瓶放在37 °C、5% CO₂加湿培养箱中。松开盖子以便换气。为获得最佳结果，接种后24小时之内不要扰动培养物。
11. 接种24小时后或过夜后，更换新鲜的胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)，以去除所有残留的DMSO。
12. 每隔一天更换一次胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)，直至细胞达到45%融合。
13. 当培养细胞融合率达到45%以上或周末饲喂时，将胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)用量加倍。
14. 当HEK培养物达到80％融合时，将细胞传代培养。

IV.传代培养HEK

A. 准备传代试剂

1. 从-20°C冰箱中取出胰蛋白酶-EDTA溶液（T3924）和胰蛋白酶抑制剂（T6414），并在冰箱中解冻一夜。
2. 确保解冻所有传代培养试剂。轻轻旋转每个瓶子几次，形成均匀的溶液。
3. 将所有传代培养试剂储存在4°C以备将来使用。
4. 等分胰蛋白酶/EDTA溶液（T3924），如果只需要一部分胰蛋白酶/EDTA（T3924），则将未使用的部分保存在-20°C。

B. 准备培养瓶

1. 从冰箱中取出胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)。在无菌超净台中用70％酒精给瓶子消毒。
2. 吸取35 mL胎儿/新生儿角质形成细胞无血清生长培养基(131-500)置于T-75培养瓶中（用于第IV C部分第15步）。

C. HEK传代培养

在室温下对细胞进行胰蛋白酶消化。请勿将任何试剂加热至37°C。

1. 从培养瓶吸取培养基。
2. 用HBSS（H6648）洗涤单层细胞，吸除溶液。
3. 取8 mL胰蛋白酶/EDTA溶液(T3924)置于T-75培养瓶(SIAL0641)中。轻轻摇动培养瓶以确保溶液覆盖所有细胞。
4. 重新盖紧培养瓶盖子，并在倒置显微镜下在室温下监测胰蛋白酶消化过程。这样做60秒。
5. 吸取胰蛋白酶/EDTA溶液(T3924)。
6. 重新盖上烧瓶盖子，置于37 °C培养箱中2分钟。
7. 用手掌拍打培养瓶侧面，使圆细胞从培养表面释放，直至大部分细胞脱落。
8. 如果没观察到细胞脱落，则将烧瓶置入培养箱中再孵育30秒，然后重复步骤7。
9. 将5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）移液至培养瓶，以抑制进一步的胰蛋白酶活动。
10. 将细胞悬浮液从培养瓶转移至50 mL无菌锥形管中。
11. 用另外的5 mL胰蛋白酶抑制剂溶液（T6414）冲洗培养瓶，并将溶液转移到同一个锥形管中。
12. 在显微镜下检查T-75培养瓶。如果培养瓶中剩余> 20％的细胞，请重复步骤2-9。
13. 将锥形管以220×g离心5分钟以沉淀细胞。
14. 从锥形管中吸取上清液而不扰动细胞沉淀。
15. 用手指轻弹锥形管的尖端以松开细胞沉淀。
16. 用移液管轻轻吹打细胞以分散细胞团块，使细胞重悬于5 mL胎儿/新生儿角质形成细胞生长培养基(131-500)中。
17. 用血细胞计数板或细胞计数器计数细胞。如想使细胞快速生长，则接种密度为7,500个细胞/cm²，如想使细胞进行常规传代培养，则接种密度为5,000个细胞/cm²。