原代细胞培养基础知识

• 什么是原代细胞？ 
• 原代细胞与连续细胞系的比较 
• 原代细胞培养应用 
• 原代细胞培养技巧和窍门 
• 相关产品 

什么是原代细胞？

原代细胞最接近起源组织。它们直接从组织中取出并经过处理，以在最佳培养条件下建立。由于它们源自组织且未经修饰，因此与体内状态更加相似，并表现出正常的生理学特征。因此，它们为研究细胞的正常生理学和生物化学性质（例如，代谢研究、衰老、信号传导研究）以及药物和有毒化合物对细胞的作用，提供了出色的模型系统。但须记住，原代细胞的寿命有限，经过一定次数的细胞分裂后将停止分裂（或衰老），比连续细胞系更难以培养和维持。研究细胞信号通路的研究人员面临的主要挑战是从供体获得和传代培养过程中诱导发生的原代细胞变异。研究人员倾向于在着手进行信号研究之前，筛选细胞对常见刺激的敏感性。预先筛选的原代细胞可以刺激激活主要信号通路，从而节省了宝贵的资源。

研究中最常用的原代细胞类型是上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、内皮细胞、肌肉细胞、造血和间充质干细胞。最初的培养物是异质的（即组织中存在多种细胞类型的混合物），只能在有限的时间范围内在体外进行培养。可通过称为转化的体外过程对原代细胞进行无限次传代培养。转化可以自发发生，也可以化学或病毒诱导。原代培养经过遗传转化（提供适当的新鲜培养基和空间）后，它们会无限分裂并成为永生化的二代细胞系。

原代细胞与连续细胞系的比较

连续细胞系通过随机突变（转化为癌细胞系）或通过针对性修饰（例如癌症基因的人工表达），具有了无限增殖能力（永生化）。连续细胞系通常比原代细胞更稳健，更易于操作。它们具有无限生长潜力，是获取基本信息的快速简便方法。使用连续细胞系的部分缺点是，它们经过基因修饰/转化，可能会改变生理特性，无法代表体内状态，且这种情况会随着不断传代进一步加剧。

原代细胞培养应用

原代细胞培养越来越多地被用作细胞和分子生物学的主要工具，为研究细胞的正常生理学和生物化学（例如代谢研究、衰老、信号传导研究）、药物和有毒化合物对细胞的影响、诱变和致癌作用等，提供了优秀的模型系统。它还用于药物筛选以及大规模开发生物化合物（例如疫苗、治疗性蛋白质）。

• 3D细胞培养：由于原代细胞是非转化的，非永生化的，因此它们非常接近地模拟生物模型并产生更多生理学上显著的结果。这些细胞可作为研究细胞生物学和生物化学的模型系统，用来研究细胞与致病因子（如细菌、病毒）之间的相互作用、药物的作用、细胞衰老过程、细胞信号和代谢调节。在许多情况下，原代细胞的使用使研究人员避免了使用动物模型所涉及的复杂情况（可用性、成本和伦理）。
• 癌症研究：原代细胞可以暴露于辐射、化学物质和病毒而癌变。因此，可以研究癌症的机制和原因以及改变的信号传导途径。它还可用于测定癌细胞的有效药物。在这个领域，还可以研究癌症治疗（化疗和放疗）对正常细胞的副作用。
• 病毒学：可以研究病毒的检测、分离、生长和发育周期。原代细胞也可用于研究感染模式。
• 药物筛选和毒性测试：原代细胞培养用于研究新药（研究效果和安全剂量）和/或药物载体（纳米颗粒）的细胞毒性。它可用于以工业规模合成或生产各种生物分子。这在制药工业中特别有用。现正在开发各种使用原代细胞的基于细胞的治疗产品的研究项目。用原代（动物细胞）培养物代替动物模型来测试新药、化妆品和化学品的效果。它们还用于确定新药的最大允许剂量。
• 疫苗生产：原代动物细胞用于生产病毒，这些病毒用于生产疫苗（例如脊髓灰质炎、狂犬病、水痘、麻疹和乙型肝炎等致命疾病的疫苗均使用动物细胞培养生产），避免使用动物模型。
• 基因工程：原代细胞培养物用于生产具有重要的商业价值的基因工程蛋白，如单克隆抗体、胰岛素、激素等。
• 组织或器官替换：原代（动物）细胞培养可用作组织或器官的替代品。目前正在研究利用原代细胞重建受损组织或更换非功能性细胞或组织。正在用胚胎和成体干细胞培养进行器官培养技术的开发和研究。这些细胞具有分化成许多不同类型的细胞和器官的能力。通过控制这些细胞的发育和分化，我们能够治疗各种疾病。原代细胞还广泛用于3D生物打印应用。
• 干细胞治疗：从骨髓、血液或胚胎中分离干细胞即涉及原代细胞培养。患者自身的干细胞或来自供体的干细胞在体外生长以产生足够的细胞，即可用于再生组织或替换功能缺陷的细胞。这是一个正在探索的领域，研究的目的是设计治疗方法治疗遗传性疾病、脊髓损伤、退行性疾病和癌症。

原代细胞培养技巧和窍门

生长要求

原代细胞可以悬浮或贴壁生长。一些细胞天生存在于悬浮状态，而不附着于表面（例如来自外周血的那些细胞）。还有一些细胞系经过修饰，能够在悬浮培养中存活，它们的生长密度高于贴壁培养条件所允许的密度。对于锚定依赖性原代细胞，贴壁细胞（如实体组织）需要贴附一个表面才能在体外适当生长。这些细胞大多在平坦的未包被的塑料容器中培养，但有时使用包被有细胞外基质（例如胶原蛋白和层粘连蛋白）组分的微载体可以提高粘附性，并提供生长和分化所需的其他信号。细胞培养基由补充有适当生长因子和细胞因子的基础培养基组成。细胞在细胞培养箱以合适的温度和气体混合（对于哺乳动物细胞，通常为37℃，5% CO₂）生长和维持。培养条件视细胞类型的不同而有很大差异。生长培养基的pH、葡萄糖浓度、生长因子和其他营养素的存在，可以随细胞类型的不同而不同。

在建立原代培养期间，必须在生长培养基中包含抗生素，以抑制从宿主组织引入的污染。使用的抗生素可能包括庆大霉素、青霉素、链霉素和两性霉素B的混合物。但是不建议长期使用抗生素，因为长期使用某些试剂（如两性霉素B）可能对细胞有毒。

分离后，保持原代细胞的活力非常重要，因为它们中的大多数经历了衰老过程，并且经过一定次数的群体倍增后会停止分裂。对于细胞的长期生存能力，优良的细胞培养处理技能以及适当的培养条件（即生长培养基、温度、气体混合物、pH、生长因子浓度、营养物和葡萄糖的存在）是必不可少的。用于补充培养基的生长因子通常来自动物血液（血液衍生成分具有污染的可能性），建议尽可能减少或避免使用这些成分。使用无菌技术也是必要的。

细胞汇合度

细胞汇合度通常是指附着的细胞所栖息的培养容器面积的百分比。例如，100％细胞汇合度意味着表面区域被细胞完全覆盖，而50％汇合度意味着大约一半的表面被覆盖。它是在原代细胞培养中追踪和评估的重要且必要的参数，因为各种细胞类型要求不同的汇合终点，在汇合终点，需要对它们进行传代培养。

维持期及传代培养

当分离的细胞附着在培养皿的表面时，细胞的维持阶段开始。细胞附着通常在培养开始后约24小时完成。当细胞达到所需的细胞汇合度并且正在活跃增殖时，就需要进行传代培养。这是在达到100％汇合度之前传代培养原代细胞培养物的最佳时间，因为汇合后细胞可能会经历分化，并且在传代后表现出较慢的增殖。

锚定依赖性细胞以单层生长，需要用适当的培养基定期进行传代培养，以维持指数生长。单层的传代培养涉及胞间和胞内与附着表面之间键的断裂。大多数贴壁原代细胞需要消化它们的蛋白质附着键，或用低浓度的蛋白水解酶（例如胰蛋白酶 / EDTA）从单层或相关组织上分离。在细胞解离并分散成单细胞悬液后，将它们计数并稀释至适当浓度，然后转移至新鲜的培养容器（培养基的组成随细胞类型的不同而不同），在那里它们将重新附着并分裂。

细胞计数

血细胞计数器通常用于估计细胞数和确定细胞活力（可以使用排除染料，例如台盼蓝）。血细胞计数器是一种相当厚的玻璃显微镜载玻片，有一个矩形凹槽。  凹槽有激光精确蚀刻的垂直线网格。网格的面积和凹槽的深度是已知的。因此，可以计算特定体积的液体中的细胞数量，从而计算液体的总体细胞浓度。

冷冻保存和恢复

冷冻保存是用低温保存结构完整的活细胞的过程。正确地冷冻保存和解冻原代细胞极为重要，以使每个过程中细胞的损害和死亡降至最低。对于人细胞，一般通过使用冷冻保护剂，例如DMSO或甘油（在正确温度下并且以受控的冷冻速率冷冻）来实现。对于大多数原代细胞，可以在补充有10％ FBS和10％ DMSO的80％完全生长培养基的混合物中实现冷冻保存。冷冻过程需要以每分钟降低1℃的速度缓慢进行，以最大限度地减小细胞内冰晶的形成。冷冻培养物需要储存在液氮（-196℃）或-130℃以下的气相中。

解冻冷冻保存的细胞的方法是将冷冻细胞浸入37℃水浴中约1至2分钟，这是一个快速完成的过程。应注意不要在解冻后离心原代细胞（因为在它们从冷冻保存中恢复的过程中极易受损伤）。解冻后最好立刻接种细胞，并且让培养物在最初的24小时内附着。¹在开始培养冷冻保存的原代细胞时，一旦细胞附着，必须立刻除去用过的培养基（因为DMSO对原代细胞有害，并且可能导致解冻后活力下降）。

原代细胞培养问题排查

• 污染：携带到培养物的原代组织污染。
• pH值变化：这可能是由于培养基中的盐分不正确、细菌或真菌污染、碳酸氢盐缓冲不足、二氧化碳张力不正确等造成。
• 最佳贴壁：：培养基附着因子不足或不存在，污染，或者细胞胰蛋白酶化过度。
• 生长缓慢：原因包括培养基pH值的变化，促进必要生长的组分/因子耗尽，有少量污染，试剂储存不当等。
• 细胞死亡：温度波动，不存在CO₂，解冻和/或冷冻保存过程中细胞损伤，毒性代谢物浓度增加，培养基渗透压不平衡导致细胞存活数减少。
• 沉淀：（无pH的变化）：在pH不变的情况下，培养基中出现沉淀可能是因为使用了冷冻培养基，在用去垢剂洗涤时残留有磷酸盐，而使粉末状培养基成分发生沉淀。
• 细胞结块：悬浮细胞可能由于钙、镁离子的存在，或由于细胞裂解和DNA释放（过度用蛋白水解酶消化）而结块。
• 造成差异：使用不同的试剂和培养基，造成用原代细胞获得的数据存在差异。不同的使用者操作方法的不同亦可造成差异。