使用BCIP / NBT底物进行免疫检测

5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐（BCIP）/ 硝基蓝四唑（NBT）是一种理想的不溶性底物，可与碱性磷酸酶一起使用。该系统产生蓝紫色产物。可以目视观察到强烈的颜色，非常稳定，并且在暴露于光时不褪色。

以下的蛋白印迹孵育和洗涤步骤在室温下在轨道摇床上进行。将一抗用来自二抗宿主动物的血清稀释，二抗宿主血清为1%浓度的TBS稀释液。其他非干扰蛋白质（例如BSA、血红蛋白、卵清蛋白）可以被替代。如果使用PVDF膜，条件可能需要优化。

1. 用一抗孵育蛋白印迹，用足够的TBS / TWEEN洗涤硝酸纤维素膜4次，每次5分钟。
   
   
2. 用一定稀释度的碱性磷酸酶偶联二抗孵育膜，1小时左右。（当使用升级版的碱性磷酸酶偶联二抗时，在TBS/TWEEN中的稀释比为1：30,000）
   
   
3. 在TBS中洗涤膜4次，每次5分钟。
   
   
4. 根据包装指导准备 SIGMAFAST™ BCIP/NBT片剂（产品货号B5655）。也可使用液体的BCIP/NBT底物（产品货号B1911）。
   
   
5. 将膜在底物混合物中孵育10-30分钟直至显色。
   
   
6. 在蒸馏水中洗涤膜数次，每次都换水，以停止反应。
   
   
7. 将膜风干，并在暗处储存于塑料套管中。

注意：干膜可以在2-8°C下储存于塑料套管中两张转印纸之间。