HL-1细胞

去甲肾上腺素 [（±）-动脉醇（Arterenol），分子量319.3

• 去甲肾上腺素由30 mM抗坏血酸组成。
• 向100 ml细胞培养级蒸馏水中加入0.59 g抗坏血酸，制成100 ml 30 mM抗坏血酸溶液。
• 向25 ml 30 mM抗坏血酸中加入80 mg去甲肾上腺素。
• 用0.2 μm Acrodisc针头过滤器进行过滤除菌。
• 将1 ml体积等分到带螺旋盖的无菌微管中，并储存在-20°C。这是10 mM（原液）去甲肾上腺素。每100 ml培养基使用1 ml原液，终浓度为0.1 mM。
• 去甲肾上腺素需要每月新鲜制备

L-谷氨酰胺

• L-谷氨酰胺以100x溶液形式供货，等分成工作体积并冷冻保存。

冷冻培养基

• 冷冻培养基由95％ FBS / 5％ DMSO组成。
• 这可在4°C下储存一周。

黄豆胰蛋白酶抑制剂

• 称取25 mg黄豆胰蛋白酶抑制剂，并置于含有100 ml Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（PBS；不含Ca2+和Mg2+）的烧杯中直至溶解。
• 用0.2 μm针头过滤器将其过滤除菌至100 ml瓶中。
• 这可以在4°C下保质一个月。

预包被培养瓶

明胶 / 纤连蛋白

• 称取0.1 g明胶，放入500 ml玻璃瓶中。
• 添加蒸馏水至500 ml标记处，然后高温高压灭菌。这种明胶在高温高压灭菌过程中会变成溶液。明胶浓度为0.02％。
• 纤连蛋白（1 mg/ml）是以液体形式装在试管中供货的。在199 ml 0.02％明胶中稀释1 ml纤连蛋白。轻轻混合，然而立即将6 ml等分到贴有标签的各个15 ml离心管中。将等分试样在-20°C冷冻保存。
• 在培养细胞之前，用明胶 / 纤连蛋白（1 ml/T25或3 ml/T75培养瓶）包被组织培养瓶。盖上培养瓶盖子，在37°C下孵育至少一小时。
• 在即将把细胞添加到培养瓶之前，吸去明胶 / 纤连蛋白。

培养细胞

• 每个工作日用含补剂的Claycomb培养基饲喂培养物（5 m/T25培养瓶）。
• 为避免在周末饲喂细胞，周五下午向每个T25培养瓶中加入10 ml含有补剂的Claycomb培养基，直到下周一早上才更换培养基。

传代 — 1:2分瓶的程序步骤

• 当细胞到货后，建议在细胞达到汇合时将它们分瓶。
• 每个T25培养瓶按1:2分瓶，共分成四个T25培养瓶。将这四个T25培养瓶中的一个作为您的“工作”细胞。
• 当剩余的三个T25培养瓶中的细胞在三天后达到汇合时，以1:3将它们分成3个T75培养瓶，然后冷冻保存。我们建议至少冷冻3个T75培养瓶。
• 因此，在收到HL-1细胞一周以后，您应该有三个冷冻管的细胞冷冻起来以备后用。
• 建议只在达到完全汇合后才将培养物分瓶。
• 用加热至37°C的3 ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）简短冲洗每个T25培养瓶（如果是T75，则用6 ml），操作方法是将PBS吸移到培养瓶底部（盖子的对面），尽量不要直接冲击细胞。轻轻冲洗，然后吸除。
• 在每个T25培养瓶中加入1 ml预热的0.05％胰蛋白酶 / EDTA（每个T75则用3ml）。在室温下孵育1分钟。
• 去除旧液，然后添加新鲜的0.05％胰蛋白酶 / EDTA。在室温下孵育另外2分钟。
• 用显微镜检查，如果细胞仍然贴附，则在工作台面上轻敲培养瓶以使贴壁细胞脱落。
• 为了使酶失活，加入等量（每个T25 1 ml）的黄豆胰蛋白酶抑制剂。
• 将细胞从培养瓶转移到15 ml离心管中。
• 用5 ml洗涤培养基（仅含5％ FBS和青霉素 / 链霉素的Claycomb培养基）冲洗空培养瓶，并加入到已装有细胞的15 ml离心管中。
• 以500 × g离心5分钟。
• 在此期间，从每个T25培养瓶中去除明胶 / 纤连蛋白溶液，并在每个烧各加入4 ml含有补剂的Claycomb培养基。搁置一边。
• 从离心机上取下含有HL心肌细胞的试管。吸除上清液，将沉淀物轻轻地重悬于2 ml含有补剂的Claycomb培养基中。
• 将1 ml细胞悬液转移到两个贴好标签的明胶 / 纤连蛋白包被的T25培养瓶中。现在每个培养瓶含有5 ml内容物。
• 如果细胞在星期五传代，则每个培养瓶用2倍体积的含有补剂的Claycomb培养基。

冷冻

建议您在收到细胞后，尽快冷冻3小管或更多（请参阅“传代”部分的说明）。这样让您返回到这个过程，并可以防止发生污染。

• 我们通常将一个汇合的T75培养瓶中的内容物放入一个冷冻管里冷冻。（当需要细胞时，就将这个冷冻管解冻到一个T75培养瓶中。）
• 用加热至37°C的5 ml PBS短暂冲洗装有HL-1培养物的T75培养瓶。吸除溶液。
• 将3 ml 0.05％胰蛋白酶 / EDTA转移到培养瓶中。
• 将培养瓶在37°C孵育1分钟。
• 从培养瓶中去除胰蛋白酶 / EDTA，再换上3 ml新鲜的0.05％胰蛋白酶 / EDTA。
• 在37°C孵育2分钟。
• 在显微镜下检查细胞是否脱落。如果没有，则在工作台面上轻敲培养瓶以使任何贴壁细胞脱落。
• 向培养瓶中加入3 ml黄豆胰蛋白酶抑制剂，将6 ml转移到15 ml离心管中。
• 用8 ml洗涤培养基冲洗每个空培养瓶，并加入到已装有细胞的15 ml离心管中。总体积现在是14 ml。
• 将管以500 × g离心5分钟。
• 吸除洗涤培养基。
• 将每个管中的沉淀轻轻重悬于1.5 ml冷冻培养基（95％ FBS / 5％ DMSO）中。
• 将重悬的细胞移液到冷冻管中。将含有细胞的冷冻管放入含有室温异丙醇的Nalgene冷冻罐中。
• 立即将冷冻罐放入-80°C冰箱中，使细胞以-1°C /分钟的速度冷冻。
• 6至12个小时以后，将小管转移到液氮杜瓦瓶中。

解冻

• 明胶 / 纤连蛋白 — 包被T75组织培养瓶，然后置于37℃培养箱孵育至少1小时。
• 从培养瓶中除去明胶 / 纤连蛋白，换成10 ml含有补剂的Claycomb培养基。将该培养瓶放回培养箱中。
• 将10 ml洗涤培养基转移到空的15 ml离心管中。将管在37°C水浴中孵育。
• 在37°C水浴中快速解冻细胞（约2分钟），然后转移到含有洗涤培养基的15 ml离心管中。
• 以500 × g离心5分钟。
• 从离心机上取下试管，吸除洗涤培养基。
• 将沉淀轻轻重悬于5 ml含有补剂的Claycomb培养基中，然后加入已装有10 ml培养基的T75培养瓶中。
• 4小时后（在细胞附着后）用15 ml新鲜的含有补剂的Claycomb培养基更换培养基。
• 冷冻管中的成分应解冻装入T25培养瓶。

特性

外观 — 清澈的橙红色溶液

内毒素 — 参见分析证书

渗透压（包装形式）— 参考分析证书

pH（如所提供的）— 7.1 - 7.4

无菌性 — 未检测到微生物生长

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