细胞培养污染问题排查
细胞培养污染：概述
尽管提到“细胞培养污染”时，人们通常会联想到细胞间的细菌和浑浊的培养基，但培养瓶中的非预期入侵者其实可以呈现多种形态。病毒和化学污染物同样会对细胞培养的健康状况产生重大影响，而确保细胞系不发生交叉污染，对于实验结果的可重复性至关重要。
细胞污染究竟有多普遍？根据美国食品药品监督管理局（FDA）、美国标准菌种保藏中心（ATCC）等机构的研究，据估计，仅就支原体而言，目前所有细胞培养中就有5%至30%受到了污染。一项研究5显示，常见细胞系的病毒污染发生率超过25%，而非细胞病变性病毒比支原体更难被检测出来，因为细胞培养状况可能无法提供其存在的线索。
图1。细胞污染
控制某种特定污染物关键有时取决于其检测的难易程度。 细菌、真菌和酵母等污染物通常肉眼可见，且可能迅速杀死培养中的细胞，但某些微生物（如支原体）的形态特征较为隐蔽，这使得识别这些重要的微生物入侵者变得更加困难。相比之下，病毒完全无法通过常规光学显微镜检测，因此其发现往往源于观察到无法解释的细胞脱落现象，或其他表明细胞健康状况不佳甚至细胞死亡的迹象。
近年来，生物学界面临的一个最重大问题是研究细胞系的污染，甚至是完全的误识。如需进一步了解这一重要议题，请点击此处，了解交叉污染细胞系的成因和普遍程度，以及如何评估细胞系身份的完整性。
支原体是一类不具备细胞壁的细菌，因此不受那些通过抑制细胞壁形成来限制细菌生长的抗生素的影响。其形态灵活，细胞大小在0.15至0.3 µm之间，这意味着它们可能逃过标准细胞培养过滤方法的拦截——这些方法通常使用孔径为0.22 µm的滤膜。 与大多数其他细菌污染物不同，支原体无法通过肉眼观察发现，且由于其形态和体积极小，难以通过光学显微镜检测。 培养基中的支原体滴度可达10⁸个/mL，却不会导致培养基混浊。它们通常不会杀死所感染的哺乳动物细胞，但会通过改变细胞代谢、引起染色体畸变、减缓细胞生长以及干扰细胞附着等方式，对培养产生显著影响。简而言之，它们极可能对使用受感染细胞系进行的大多数实验结果产生重大影响。
图2。通过荧光显微镜，DAPI或Hoechst等常见的DNA检测试剂可显示受污染培养物中存在支原体（右图）。
实验室中支原体污染的多种来源可能带来挑战。由于某些支原体菌种存在于人体皮肤上，因此除了通过受污染的补充剂（如胎牛血清）引入外，还可能因无菌操作不当而引入。 支原体在相邻的受污染细胞培养物之间具有极强的传播性。处理支原体时，必须使用孔径为0.1 µm或更小的膜对培养基和缓冲液进行过滤，因为孔径为0.22或0.45 µm的标准培养基过滤装置无法阻隔这些微小微生物。
预防、检测和消除支原体污染
一旦支原体污染了培养物，就会迅速扩散到实验室的其他区域。严格遵守良好的实验室操作规范是关键，并且强烈建议进行常规的支原体检测，以成功控制支原体污染。 最常用的三种检测方法包括支原体培养、DNA染色法和基于PCR的检测。我们提供多种用于支原体检测和消除的解决方案。即使您不怀疑实验室中存在这种污染物，建立培养物支原体筛查的常规流程也至关重要。
预防微生物污染：抗生素是解决之道吗？ 组织培养中的一项常规做法是使用抗生素，无论是单独使用还是与抗真菌药物混合使用。正如医生开具的治疗性抗生素一样，持续或不恰当地使用抗生素可能会导致耐药菌株的产生，这些菌株难以根除，且可能需要使用对细胞培养具有毒性的新一代抗生素。最近的研究还提出了新的担忧：在抗生素存在的情况下，培养细胞的基因表达可能会发生改变。 |
病毒污染
病毒是细胞培养中最难检测的污染物之一，其检测需要借助显微镜技术，而这种方法对于大多数研究实验室而言并不现实。病毒可能源自患者或宿主动物细胞源，且已有研究表明，若干具有生物技术重要意义的细胞系中含有内源性逆转录病毒。更常见的情况是，细胞因用于培养的动物源性材料中存在的病毒而受到感染。 病毒体积微小，因此很难从培养基、血清及其他生物来源的溶液中去除。然而，由于大多数病毒具有宿主特异性，甚至组织特异性，这可能限制了它们进行跨物种或跨组织感染的能力。尽管病毒在细胞培养中的存在可能比许多研究者意识到的更为普遍，但如果它们未对细胞诱发细胞病变或其他不良影响，则未必会成为细胞培养中的显著干扰因素。
除了可能影响培养细胞之外，使用病毒感染的细胞培养物的一个主要担忧是它们对实验室人员可能造成的健康危害。 在处理来自人类或其他灵长类动物的组织或细胞时，应始终采取特殊的安全预防措施，以避免病毒感染（如艾滋病毒、乙型肝炎病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、猿疱疹B病毒等）从细胞培养物传播给实验室人员。关于处理潜在危险组织、培养物或病毒的操作规程，应咨询机构环境安全负责人。有关从事细胞培养工作的实验室人员风险评估的更多信息，请点击此处
降低细胞培养中病毒污染发生率的最佳实践：
*限制细胞提取的生物来源（供应商、动物）的数量。
*选择对病毒易感性较低的动物/细胞。
*从进行病毒检测并提供无病毒细胞系认证的细胞库获取细胞。
化学污染
细胞培养中的任何非生物污染物通常被归类为“化学”污染物。这些污染物可能源自培养基或缓冲液中所用的试剂或水，也可能来自设备和耗材。例如，自由基、金属离子、消毒剂/洗涤剂残留物，甚至在上游细菌污染物已不存在后仍残留的内毒素。
预防化学污染的建议：
*配制缓冲液和溶液以及复溶冻干试剂时，务必使用实验室级水。
*任何可重复使用的实验器具都必须彻底冲洗并自然晾干——高压灭菌对洗涤剂残留无效。
*培养基、补充剂和血清（FBS、FCS）应仅从提供内毒素检测证书的供应商处采购。
预防和消除污染的一般建议与技术
在生物安全柜内操作
在生物安全柜内操作时，请务必记住，气流是维持无菌环境的关键。为确保气流顺畅，前后通风口应始终保持畅通。在进行任何操作前，应将所需的所有材料预先放入柜内，以最大限度地减少污染物通过操作人员衣袖和双手传播的风险。
启动气流后，应至少等待二十分钟，再将待用物品放入实验柜内。所有进入实验柜的物品必须先用70%（体积比）无菌酒精喷洒，并用无绒布擦拭，以防止灰尘和颗粒物进入实验柜。在打开任何盖子或容器之前，请确保气流已稳定建立，以便气流将可能被带入的工作区域中的颗粒物排出。
图3。在安全柜中操作
移液操作与气溶胶预防
一次性塑料移液管（也称为血清移液管，容量范围为1–100 mL）是细胞培养中不可或缺的工具。这些移液管必须单独包装以确保无菌。遵守以下指南可最大限度地减少移液过程中相关的污染和安全风险。
- 使用自动移液辅助装置，且每个辅助装置仅限于在单个通风柜内使用。为避免污染，应定期拆卸并消毒移液辅助装置的各部件。确保移液辅助装置的滤芯储备充足并定期更换。
- 尽可能使用带塞移液管（顶部用棉花塞住），尤其是在转移培养基时。避免将液体吸入移液管塞中。如果塞子不慎沾湿，请立即更换移液辅助器的滤芯。
- 完全避免接触血清移液管：先部分拆开包装，将移液管一端装入移液辅助器，然后取下纸套。
- 为避免产生污染性气溶胶，请勿在培养基或移液管中产生气泡。
消毒
用于培养废弃物、工作台面和设备消毒/去污的方法，不仅必须将污染风险降至最低，还必须对实验室人员安全。使用浓缩型消毒剂时，务必始终佩戴适当个人防护装备（PPE），例如手套和护目镜。所选手套应能抵御所处理物质的侵害。制造商提供的对照表有助于确定适合特定任务的最佳手套。 主要消毒剂可分为几类，其相对优缺点可总结如下：
次氯酸钠或漂白剂
- 良好的通用消毒剂
- 对病毒有效
- 对金属具腐蚀性——不应用于离心机等金属表面
- 易被有机物失活，因此应经常配制新鲜溶液
- 使用市售漂白剂配制10%（体积比）溶液，用于处理废液或表面消毒
酒精（例如乙醇、异丙醇）
- 有效浓度：乙醇为70%，异丙醇为60-70%
- 对细菌有效。乙醇对大多数病毒有效，但对无包膜病毒无效
- 异丙醇对病毒无效
- 醛类具有刺激性，应限制其使用
应避免使用酚类消毒剂，因其未被纳入欧盟《杀生物剂产品指令》审查计划。
如何对健康细胞进行例行监测
监测细胞培养是日常细胞培养工作的重要组成部分。本教程将帮助您了解细胞监测的基础知识，包括健康细胞培养的特征、细胞汇合度以及细胞培养生长的不同阶段。本视频还将展示细菌和支原体污染的常见迹象。