面向全基因组扩增(WGA)的SeqPlexDNA扩增试剂盒(SEQXE)专用于对极小量或降解/高度片段化的DNA进行下一代测序(NGS)。染色质免疫沉淀(ChIP)或福尔马林固定的石蜡包埋组织样品(FFPE)的DNA含量往往无法满足成功制备下一代测序文库的需求。通过SeqPlex试剂盒可对这类DNA以及其他用于NGS的小量/高度片段化DNA样品进行预扩增。
SeqPlex流程包含三个步骤:预扩增、扩增和引物去除。参见以下SeqPlex工作流程图。
所有组分应储存在-20°C条件下。解冻使用时,所有组分应保存在冰上。通过在37℃条件下短暂加热并充分混合,以溶解溶液中的任何可能沉淀物。若储存在–20 °C以上环境或长期放置在4 °C以上环境中,会影响文库制备酶和引物去除酶的稳定性。
以下步骤已成功用于扩增和测序100 pg的ChIP分离DNA和100 pg的片段化基因组DNA。受损DNA,如从FFPE组织中分离出来的DNA,可能需要5-10倍的起始DNA量——具体取决于DNA的受损程度。反应可以放大或缩小,以便制备所需数量的扩增DNA。
注意:扩增和引物去除后的最终得率很大程度上取决于起始DNA的量。在大部分情况下,可得到1-2μg。多次反应可获得更多产物。
注意:该操作步骤是应使用本试剂盒随附或推荐使用的试剂开发的。更换试剂可能无法获得最佳结果。
*为了获得最好的效果,强烈建议在进行实时PCR时在扩增反应中加入SYBRGreen I,以监测反应过程。为避免抑制扩增反应,SYBRGreen I (S9430) 必须稀释1,000倍(1/1000)并且每个75 µl SeqPlex扩增反应仅使用1µl稀释液。除S9430外,其他SYBRGreen配方未经过测试,不推荐使用。
在扩增“平台期”开始后至少2-3个循环时,可达到最佳效果,如图1所示。最佳扩增循环数取决于起始DNA模板的数量和质量。
如果扩增反应不添加SYBRGreen I,使用0.1-1.0 ng高质量DNA通常可在18-24个循环获得良好结果。低质量DNA可能需要更高的起始量和/或更多的循环。如果起始量接近
10 pg,则可能需要多达29个循环才能到达扩增平台期。
注意:如果达到平台期需要的循环数超过29个,则后续的NGS结果可能会不符合要求。请查看故障排除指南。
10.充分混匀,并按以下设置在实时荧光定量热循环仪中运行:
初始变性:94 °C,2分钟
循环至平台期开始后的2-3个循环:
94 °C变性15秒
70 °C退火/延伸5分钟
(读取荧光值)
循环后:
70 °C,30分钟
4 °C,保温
注意:循环后在70°C的延伸孵育对于有效去除引物至关重要。
反应物可立即纯化或先保存在–20 °C。
11.使用GenElute PCR Clean-Up Kit (NA1020)进行纯化。使用50 µL无核酸酶的水进行洗脱。
12.通过测量260nm处的吸光度,测定纯化DNA的浓度。每A260单位等同于50ng/uL DNA。在该点的得率取决于起始DNA的质量,但通常在1-5 µg范围内。
注意:其他测量技术,如PicoGreen®,通常会低估实际SeqPlex DNA得率。
此时,SeqPlex DNA适用于qPCR和基因芯片。为进行深度测序,建议去除SeqPlex引物。
可选: 可通过凝胶电泳或毛细管电泳评估扩增质量。一般情况下,毛细管芯片需要1µL的粗扩增产物或纯化扩增产物,如Agilent生物分析仪,而琼脂糖凝胶电泳通常需要5 µL。
注意—GenomePlex WGA资深用户:
SeqPlex增强型(SEQXE) 引物去除试剂不适用于采用上一代SeqPlex (SEQX)或GenomePlex (WGA1-5)扩增获得的DNA。
为获得足以满足大部分深度测序工作流程需要的产物量(>1μg),建议的反应起始量为2.1 μg。
13.在冰上完成以下试剂添加步骤:
8.0 µL - 10x 引物去除缓冲液 (SR401)
1.6 µL - 引物去除溶液 (SR400)
X µL – 2.1 μg 纯化 SeqPlex DNA
Y µL - 水 (W4502)
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76.25 µL 总反应体积
14混匀。如果要进行可选的引物去除测定(参见附录1),则取出5 µL 置于独立试管中,作为“无引物去除酶”对照。
15向第13步剩余的71.25 µL反应液中加入3.75 µL引物去除酶(SR402)。
16按以下设置,孵育有酶和无酶反应:
37 °C,60分钟
65 °C,20分钟
4 °C,保温
17从热循环仪中取出反应物,短暂离心并混匀。反应物可在–20 °C保存最多3天,也可立即纯化。
18如果要进行可选的引物去除测定,则在纯化前从“有引物去除酶”反应物中取出5 µL并保存(参见附录1)。
19按之前第10步所述方法,使用GenElute PCR Clean-up Kit的引物去除酶纯化剩余的反应物。
SeqPlex DNA现在可立即用于下一代测序工作流程,包括末端制备,但通常不需要片段化或大小筛选。大部分SeqPlex DNA的长度介于200-500个碱基对之间。尽管通常没有必要,但可通过物理或酶解方法进行额外的片段化处理。
去除引物后,每个SeqPlex扩增子末端将具有一个5’-磷酸和一个2-碱基的3 '-突出端。在进行测序引物连接之前,采用T4聚合酶对双链片段的两端进行修复。
在引物去除处理后,任何保留引物的SeqPlex扩增子将具有一个5 ' -羟基。无需T4 DNA激酶处理,并且其缺失将减少测序引物与任何残留的未消化SeqPlex引物的连接。
Illumina工作流程中的3 ' -腺苷酸化在很大程度上阻止了连接产物的出现,如嵌合体。嵌合体已被报道出现于Roche 454文库制备和测序中。对于ABI SoLID测序,测序前的二次筛分步骤可能有助于减少嵌合体或串联体。
该试剂盒已被证明可用于扩增ChIP DNA样品和全基因组片段化DNA模板。请注意,高复杂度DNA样品(如ChIP输入DNA)与低复杂度DNA样品(如ChIPed DNA)中的相同序列可能具有不同的扩增程度。因此,最好以复杂度相近的样品进行扩增程度比较,如来自经处理和未处理细胞或肿瘤和正常组织的ChIPed DNA。
SeqPlex DNA已成功用于为采用标准Illumina工作流程方案的Illumina GAIIx和MiSeq制备测序样品,包括:末端制备、精修、扩增和大小筛选。
在将样品用于下一代测序前,我们强烈建议在引物去除后使用已知存在于起始DNA中的短(<300bp)DNA序列的引物进行PCR,以确认SeqPlex DNA的质量。
注意:含有5’-CTGAAG-3’或5’-CTTCAG-3’序列的PCR产物或引物在去除引物后不会扩增。
在去除引物后不会扩增的PCR产物实例:
在引物去除之前或之后,SeqPlex DNA中的特定靶点也可通过PCR或基因芯片来确认。
SeqPlex DNA的稳定性与在相同条件下储存的基因组DNA相当。
可选: 引物去除检测
使用5X扩增混合液(A5112)、SeqPlex DNA聚合酶(SP300)和5 µL来自上述第18和14步的“有”和“无引物去除酶”剩余样品,通过qPCR评估引物去除效率。试剂盒提供的5X扩增混合液和DNA聚合酶足以用于每个扩增反应中“有”和“无引物去除酶”样品的引物去除检测。
如果在至少4个循环时,“有”引物去除酶反应的Ct/Cq值大于“无”酶反应的Ct/Cq值,表明引物去除成功。
故障排除指南 |
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