α-淀粉酶酶促测定 (EC 3.2.1.1)

概述：α-淀粉酶活性的测定

本操作规程可以用来测定α-淀粉酶的活性。

分光光度终止反应测定法（A₅₄₀，光程 = 1 cm）基于以下反应：

单位定义：在pH 6.9、温度20 °C条件下，一个单位可在3分钟内从淀粉中释放出1.0 mg麦芽糖。

所需试剂和设备

磷酸一氢钠，产品编号S0751

氯化钠，产品编号S9888

马铃薯淀粉，产品编号S2004

氢氧化钠，产品编号S5881

酒石酸钾钠，四水化合物，产品编号S2377

3,5-二硝基水杨酸，产品编号D0550

D‑(+)‑麦芽糖，一水化合物，产品编号M9171

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水（25°C时电阻率 ≥ 18 MΩ×cm）制备试剂。

缓冲液（20 °C，20 mM磷酸钠与6.7 mM氯化钠，pH 6.9）— 用超纯水制备含有2.4 mg/mL 磷酸一氢钠（产品编号：S0751）、和0.39 mg/mL氯化钠（产品编号：S9888）的溶液。  在20 °C，用1 M NaOH/1 M HCl将pH值调节为6.9。

淀粉溶液 [1.0% (w/v) 可溶性淀粉溶液] — 用缓冲液和马铃薯淀粉（产品编号：S2004）制备10 mg/mL的溶液：

• 在加热 / 搅拌器上，边搅拌边加热至沸腾15分钟使溶液完全溶解。
• 从加热 / 搅拌器上取下来。继续搅拌该溶液直到降至室温。
• 用超纯水将溶液定容。
• 在整个测定程序中持续搅拌溶液。

2 M氢氧化钠（NaOH）溶液 — 用超纯水和氢氧化钠（产品编号：S5881）制备80 mg/mL的溶液。

5.3 M酒石酸钾钠四水化合物溶液 — 用2 M氢氧化钠（NaOH）溶液和酒石酸钾钠四水化合物（产品编号：S2377）制备1,496 mg/mL的溶液。  将溶液放在加热/搅拌器上，边搅拌边加热使固体物质溶解。请勿加热至沸腾！

96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液 — 用超纯水和3,5‑二硝基水杨酸（产品编号：D0550）制备21.9 mg/mL的溶液。  将溶液放在加热/搅拌器上，边搅拌边加热使固体物质溶解。请勿加热至沸腾！

显色剂溶液 — 制备40 mL， 加入：

• 将12.0 mL 温热（50–70 °C）超纯水添加至大小合适的琥珀色瓶子里。
  边搅拌边慢慢添加：
• 8.0 mL温热的5.3 M酒石酸钾钠四水化合物溶液
• 20.0 mL温热的96 mM 3,5-二硝基水杨酸溶液

该溶液在室温避光条件下可以保持稳定6个月。可以视需要调整制备的体积。

0.2% (w/v) 麦芽糖标准溶液 — 在容量瓶里用超纯水和D‑(+)‑麦芽糖一水化合物（产品编号：M9171）制备2 mg/mL的溶液。

α-淀粉酶样品溶液 — 20 °C下用超纯水制备含有0.75‑1.5 个单位/mL α-淀粉酶的溶液，制备完成后立即使用。

操作流程

最终测定浓度 — 在2.00 mL反应体积中，最终浓度为0.50% (w/v) 淀粉和约1个单位的α-淀粉酶。

1. α-淀粉酶样品测定

a. 用移液枪 (mL计) 将以下试剂转移到合适的容器中：

b. 涡旋混合并平衡至20 °C。然后加入（mL计）:

c. 涡旋混合并在20 °C刚好孵育3.0分钟。然后加入：

d. 用可以排气的盖子盖好容器，放入沸水浴刚好15分钟。

e. 从沸水浴中取出容器。然后添加（mL）：

f. 在冰上使溶液降至室温。

g. 然后添加（mL计）：

h. 倒置混合。将合适的分光光度仪在540nm以空气归零，并记录样品和空白样品的A₅₄₀读数。

2.作标准曲线

a. 用移液枪（mL计）将以下试剂移入合适的容器，以作出标准曲线：

说明：可以视需要添加更多的标准溶液。

b. 用可以排气的盖子盖好容器，放入沸水浴刚好15分钟。

c. 从沸水浴中取出容器。在冰上使溶液降至室温。

d. 然后添加（mL计）：

e. 倒置混合。将合适的分光光度仪在540nm以空气归零，并记录标样和空白标样的A₅₄₀读数。

结果

计算

1. 确定每个标样和空白标样之间的差值ΔA₅₄₀。
   ΔA_{540 (标样)} = A_{540 (标样)} – A540 _{(空白标样)}
2. 用线性回归法制作标准曲线，即绘制标样ΔA₅₄₀与麦芽糖mg数的关系曲线。
3. 确定每个样品和空白样品之间的差值ΔA₅₄₀。
   ΔA_{540 (样品)} = A_{540 (样品)} – A_{540 (空白样品)}
4. 用标准曲线确定释放的麦芽糖mg数。
   
   
5.     

式中：
df = 稀释倍数
mL酶 = 在步骤1b中加入的样品mL量。

6.