淀粉葡萄糖苷酶的酶学测定
（EC 3.2.1.3）

描述

本操作程序可用于使用淀粉作为底物测定淀粉葡萄糖苷酶的活性。分光光度法停止速率测定 [340 nm处的吸光度（A₃₄₀），光程= 1cm] 基于以下反应：

     淀粉葡萄糖苷酶
淀粉+水 ––––––––––––––––> D-葡萄糖

  己糖激酶
D-葡萄糖 + ATP ––––––––––> 葡萄糖-6-磷酸盐 + ADP

        G-6-PDH
葡萄糖-6-磷酸盐 + β-NADP ––––––––––> 6-PG + β-NADPH

ADP - 二磷酸腺苷
ATP - 三磷酸腺苷
G-6-PDH ​​- 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
β-NADP - β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，氧化形式
β-NADPH - β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐，还原形式
6-PG - 6-磷酸-D-葡糖酸盐

单位定义 — 一个单位的淀粉葡萄糖苷酶在pH 4.5、55 °C下，在3分钟内从淀粉中释放1.0 mg葡萄糖。

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

所需试剂和设备

三水合乙酸钠 (S8625)
马铃薯淀粉 (S2004)
6.1 N 三氯乙酸溶液 ~100% (w/v) (T0699]
葡萄糖测定试剂 (G3293)
碳酸氢钠 (S8875)

制备说明

使用超纯水（25 °C时≥18 MΩxcm电阻率）制备试剂。

缓冲液（50 mM乙酸钠，pH 4.5，55 °C）— 使用三水合乙酸钠（S8625）在超纯水中制备6.8 mg/mL溶液。在55 °C下，使用1 M HCl调整pH至4.5。

淀粉溶液 [1％（w/v）] — 用马铃薯淀粉（S2004）在缓冲液中制备10 mg/mL溶液。在60-80 °C下加热约15分钟以促进溶解。不要煮沸。在整个测定过程中使溶液缓慢混合。

酶溶液（淀粉葡萄糖苷酶）— 在即将使用前，在冷的超纯水中制备溶液（0.40 - 0.80 mg固体/mL）。然后立即在55 °C纯水中稀释至0.3 - 0.6单位/mL淀粉葡萄糖苷酶。最终反应混合物必须含有0.15 - 0.60单位的淀粉葡萄糖苷酶。

TCA溶液 [（50％（w/v）三氯乙酸溶液] — 在超纯水中制备2倍稀释的6.1 N三氯乙酸溶液[~100% (w/v)（T0699）。

葡萄糖测定试剂（HK）— 在即将使用前，用超纯水溶解一小管葡萄糖测定试剂（G3293）的内容物，使用标签上包装大小所示的体积。

操作流程

在2.00 mL反应混合物中，最终浓度为25 mM乙酸钠、0.5％（w/v）淀粉和0.15–0.60单位淀粉葡萄糖苷酶。

酶促停止反应

1.将下列试剂移至合适的容器中：

2.平衡到55 °C。然后添加：

3.立即旋流混匀并在55 °C孵育刚好3分钟。然后添加：

4.涡旋混合，并用固体碳酸氢钠（S8875）调节至pH 7.0。

5.通过0.1 μM PVDF注射器式滤器（F7523）过滤，并在酶活性测定步骤4中使用滤液。

酶活性测定

1.移取以下试剂到合适的比色皿中：

2.平衡至25 °C。使用合适的恒温分光光度计监测A₃₄₀ ，直至恒定。

3.记录测试和空白试样的初始A₃₄₀。

4.然后添加：

5.立即倒置混合。监测A₃₄₀，直到DA₃₄₀/min < 0.0020，并且此速率保持至少5分钟。

6.记录测试和空白试样的最终A₃₄₀ 。

结果

计算

1.ΔA₃₄₀ = A₃₄₀ 最终 – A₃₄₀ 初始

2.

式中：

180 = 每微摩尔葡萄糖的葡萄糖微克数
2.3 = 酶促终止反应的总体积（以毫升计），步骤1-5
3.0 = 酶活性测定的总体积（以毫升计），步骤1-6
df = 稀释因子
6.22 = β-NADPH在340 nm处的毫摩尔消光系数
1,000 = 从微克到毫克的转换系数
ml酶 = 在酶促终止反应中添加的酶溶液的体积，步骤2
0.20 = 用于酶活性测定的酶促终止反应的体积（以毫升计）

3.

03/14-1