Amicon^® Ultra超滤离心管在MALDI质谱分析中纯化血清多肽

生物标志物在药物发现和开发中起关键作用，为遗传易感性、疾病进展和药物反应研究提供有力线索。血清是假定蛋白标志物的主要来源，探索其新标志物的一大阻碍是血浆或血清中的盐类、蛋白质和脂质会干扰多肽的质谱分析。目前可使用多种方法提取和富集组织和体液中的多肽：

• 蛋白沉淀后，通过C18树脂反相色谱分离
• 乙腈沉淀大蛋白，同时增强小蛋白和多肽的溶解
• 超滤法制备低分子量组分用于生物标志物分析^1–4

超滤法结合C18树脂固相萃取(SPE)是血清多肽纯化的便捷、高效方法，获得的适合质谱分析的多肽比乙腈沉淀法更多。此外，过滤辅助样品制备(FASP)最初依托我们的Microcon^®超滤离心管开发⁵，最近又依托我们的Amicon^® Ultra超滤离心管进行了优化⁶。

FASP法的一个优点是样品无需干燥/沉淀处理、仅通过几步离心就能完成缓冲液置换和浓缩。使用我们的MultiScreen^®超滤膜板还能将FASP改造为96孔板形式⁷。96孔板形式方便更快地处理生物材料，也为未来的自动化操作打下基础。

方法

I. 血清多肽制备

1. 用10%乙腈或10-20 mM tris HCL缓冲液(pH 7.5)1:1稀释1-4 mL血清、血浆或细胞裂解物。
2. 在Amicon^® Ultra-4 10K NMWL超滤离心管中加入所得样品，在吊桶式转子中3000 x g离心15-30分钟。
3. 收集滤液。
4. 如样品中含有乙腈，将其置于真空离心机中蒸发试剂。如不含乙腈，可直接进行步骤5。
5. 用5 μL的1% TFA酸化10 μL滤液。
6. 按照ZipTip^® μC18 吸头（微量色谱柱）使用方法，脱盐浓缩液并洗涤样品。
7. 用2 μL ∂-氰基-4-羟基肉桂酸基质（5 mg/mL，溶于50%乙腈，0.1% TFA）将样品直接洗脱在MALDI靶板上。注意：假如在过滤前血清加入乙腈，进行ZipTip^®纯化前需将样品在Speed Vac^®真空离心机中短暂离心去除该溶剂。

II.使用Amicon^® Ultra 4 mL 10kDa离心超滤管滤液进行质谱法多肽分析

1. 用1% TFA酸化细胞裂解物或人血清来源的含肽超滤液，按照说明书步骤使用ZipTip^® μC18或ZipTip^®强阳离子交换吸头（微量色谱柱）进行浓缩。
2. 样品加入1 μL的∂-氰基-4-羟基肉桂酸基质（5 mg/mL，溶于50%乙腈，0.1% TFA），在MALDI质谱仪上分析。

III.通过乙腈沉淀法制备血清多肽（对照样品）

1. 如步骤I.1所示，用10%乙腈1:1(v:v)稀释样品。
2. 在15 mL离心管中加入样品，离心沉淀蛋白质。
3. 收集上清，置于speed-vac真空离心机中蒸发乙腈。
4. 用0.1% TFA重悬样品，在ZipTip^® μC18吸头中脱盐和浓缩。
5. 用2 μL的∂-氰基-4-羟基肉桂酸基质（5 mg/mL，溶于50%乙腈，0.1% TFA）直接在MALDI靶板上共洗脱。

结果

Amicon^® Ultra-4 30K NMWL离心超滤管可用于制备适合高分辨率质谱分析的血清多肽。相比未处理的大鼠血清，乙腈沉淀法去除大蛋白后的质谱数据质量更高（图1A，B）。血清经过超滤处理后，MALDI-TOF检测的多肽谱峰的数量和质量大为改善（图1B）。

在样品制备方案中增加反相色谱处理后（单独，或结合乙腈沉淀和超滤离心法），数据质量进一步提高（图2）。ZipTip^® μC18吸头式微量色谱柱作为便捷、高效的工具，适合用于质谱分析前的微量样品制备。结合全部三种方法制备的样品，信号、信噪比和检测多肽数量均达到最高（图2D）。

该方法可直接结合ZipTip^® μC18吸头用于MS/MS多肽鉴定，或作为SELDI-TOF法表面介导富集前的初步处理。这些样品制备方案也可用于其他低分子量标志物，例如药物和代谢产物。