荧光寿命测量

简介

荧光寿命(FLT)是荧光团在发射光子并返回基态之前花费在激发态的时间。根据荧光基团的不同，FLT可以从皮秒到数百纳秒不等。

荧光团群的寿命是指经荧光或非辐射过程的能量损失后，激发态分子数量以指数方式衰减到原始数量的N / e（36.8％）的时间。

荧光寿命是荧光团的固有属性。FLT不依赖于荧光团浓度、样品吸收、样品厚度、测量方法、荧光强度、光漂白和/或激发强度。它受外部因素影响，如温度、极性和荧光淬灭剂的存在。荧光寿命对依赖于荧光团结构的内部因素敏感。¹

确定荧光团荧光寿命的方法

荧光寿命可以在频域或者时间域测量。

时间域测量方法涉及用短光脉冲照射样品（比色皿、细胞或组织），然后随时间测量发射强度。FLT由衰减曲线的斜率确定。有几种荧光检测方法可用于寿命测量，其中时间相关单光子计数（TCSPC）可实现简单的数据收集和增强的定量光子计数。

频域方法涉及高频率入射光的正弦调制。在该方法中，发射发生在与入射光相同的频率处，并且随着激发光兼有相位延迟和振幅的变化（解调）

荧光寿命测量相对于基于强度测量的优势²

1. 寿命测量不需要波长比率探针来提供众多分析物的定量测定。
2. 寿命法通过使用光谱位移探针扩展了分析物浓度范围的灵敏度。
3. 寿命测量可用于没有直接探针的分析物。包括葡萄糖、抗原或基于荧光能量转移转导机制的任何亲和力或免疫测定。

应用

荧光寿命分析：

荧光寿命是用于几种生物测定的稳健参数。它有可能替代传统的测量技术，如吸收法、冷光法或荧光强度法³。荧光团物理化学环境的任何变化都会导致荧光寿命的改变。可通过各种机制来研发基于寿命的分析，例如简单的结合测定，涉及到两个组分的结合（一个被荧光标记）而引起FLT的变化。另一种机制是猝灭释放型测定，涉及大量过量存在的猝灭物质，其具有低而有限的荧光。一旦荧光化合物被释放（通过酶促反应或与互补DNA结合），系统的寿命就会改变。FLT可与FRET（荧光共振能量转移）分析结合用于能量转移效率测量。

荧光寿命感测：

该技术基于探针寿命或衰减时间的变化。纳秒(ns)的衰减时间可以通过相位调制来测量。该技术已被广泛用于检测pH、Ca²⁺、K ⁺、葡萄糖和其他代谢物。通过使用具有在近红外区域激发和发射光谱的光学探头，基于寿命的感测方法在组织和其他随机介质中的应用已有最新的发展。^4,5

荧光寿命成像（FLI）：

这种技术相对较新，涉及到同时在图像的每个像素处确定荧光衰减时间的空间分布。它基于荧光团的荧光寿命取决于其分子环境而并非浓度的事实。它可以用于无法控制局部探针浓度的荧光显微镜中。荧光寿命成像显微镜(FLIM)可用于测量分子环境参数，通过荧光共振能量转移(FRET)进行的蛋白质相互作用，并可以通过细胞和组织的自发荧光来测量其代谢状态。分子环境参数可以通过因荧光淬灭或荧光团的构象变化而引起的寿命变化来测量。FLIM可用于多种生物应用，包括组织表面扫描、组织类型绘图、光动力治疗、DNA芯片分析、皮肤成像等⁶。

弱发射体具有较短的荧光寿命，而寿命较长的荧光团具有较低的光子周转率。由于其有限的灵敏度以及曝光和采集时间较长的必要性，它们对于寿命成像并不是很有用。

下面列出了寿命成像中常用的不同类型的荧光分子和探针：