利用亲脂性膜染料进行细胞示踪

最佳的染色结果是研究肿瘤发生和进展的一项关键组成部分。了解关于染色应用的有用建议和技术，包括来自近期研究的案例。

摘要

PKH26、PKH67以及CellVue^® Claret等亲脂性细胞示踪染料几乎可用于对任何细胞进行标记，使得癌症生物学家可在体内和体外对一系列不同的肿瘤及免疫细胞功能进行追踪。这些功能包括：迁移和粘附；干细胞和祖细胞的增殖；分化和增殖控制；抗原递送机制（如膜转移、吞噬作用）；以及效应细胞和调节细胞之间包括与肿瘤细胞间的相互作用。本文对使用这些染料进行最佳染色的方法进行了总结，并列举了最近文献中的实例来说明它们在肿瘤进展和抗肿瘤免疫治疗相关机制研究中的作用。

方法

常规膜标记

借助于使用我们细胞接头试剂盒中所提供的染色载体Diluent C，常规的膜标记可通过将示踪染料的长链烷基尾近似即刻的分配到膜双层中而完成 (图S1*)。这种标记的方法快速、简便并可适用于任何带有膜的细胞或颗粒(图S2*)，但要想获取明亮、均一且可重复的标记结果则需要更多关注于不同的变量，而不是利用抗体或其他平衡结合试剂的时候。^1–3 尤其是：

• 最终的染色强度取决于细胞浓度以及染料的浓度。获取明亮、均一的标记结果所需的染料量随着待染色细胞的总数以及尺寸大小（即膜的总量）的增加而增加。不幸的是，很多作者只对所用染料的浓度进行了报道。表S1* 总结了数种膜染料被报道的非干扰染色条件，但从文献中所发现的浓度应始终需要在每个实验室的目标细胞类型上再进行检测。根据我们的经验，针对恒定细胞浓度的初步滴定是选择可提供接受范围内标记后活力、恢复率和荧光强度以及未改变细胞功能的优化染料浓度的最简单方法。^2,3
  
  
• 均一的标记需要细胞和染料快速、均一的混合。由于细胞和染料的比例会影响到染色的强度，将所有的细胞同时暴露在县共同浓度的染料下是非常重要的。由于染料被吸收至膜中的速度很快，相对比将极小体积的浓缩乙醇染料加入至存在于Diluent C中较大体积的细胞，把相似体积的细胞和染料（两者均预分散至Diluent C中）进行混合则更容易实现这一点（图S1*)。加入和混合的过程应当尽量同步完成。理论上，将细胞加入染料和将染料加入细胞应该没有区别，但我们的经验是对于新手来说将细胞加入染料会更可靠的获取均一的标记。³
  
  
• 在染色前即刻制备2X 染料及2X 细胞悬浮液。Diluent C是一种水相的染色载体设计用于保留细胞活性和膜染料在溶液中足够长的时间以完成简短的标记步骤。它可将膜染料的聚集降至最低并通过避免盐的引入而最大程度提升染料的效率，同时通过维持渗透压和避免有机溶剂而降细胞毒性降到最低。然后，生理性盐的缺乏也在延长的期间会损伤细胞的活力而染料的聚集即便是在无盐的条件下也会逐渐形成。^1–3
  
  
• 使用纯净的胎牛血清（FBS)或其他系统兼容性蛋白作为“终止”试剂。由于标记时通过分配而非平衡结合而发生的，只要细胞与染料发生接触，染料就会一直被吸收进入膜并最终对膜的完整性和功能造成损害。缓冲盐溶液的加入或无血清培养基会通过引起快速的染料聚集而终止标记。然而，细胞偶联的染料聚集并不能通过洗涤过程而被有效去除，并作为存在于检测体系中并可转移至未标记细胞的未结合染料的来源。因此，存在一定相应浓度的蛋白溶液（如FBS、10-15mg/mL白蛋白）会更适合作为“终止”试剂。FBS可为过量的染料提供疏水结合位点，而其较低的盐浓度则可减少聚集。³ 在必须避免动物来源蛋白的系统中，重组白蛋白可能是一种可接受的替代品。

增殖示踪

除了可用于常规的膜标记和细胞示踪外4，表S2*中的膜染料还被证明可用于基于染料稀释原理的增殖监测。² 荧光强度在非分裂细胞中可稳定数周至数月，但在分裂细胞中，随着染料在每一轮分裂中被均匀地分配到子细胞中，其荧光强度也在逐渐降低。利用流式细胞仪和市售的软件，可通过将其强度与标记后即时的起始群体的强度进行比较来估计每个细胞经历了多少次分裂（图1），并从该信息中确定前体频率以及特定刺激引起的扩张程度等。通过表型试剂的复染而对目标亚群的鉴定可实现在复杂的细胞群体内对分化增殖进行监测，免去了对亚群进行分离的必要。散发从绿光至远红光（表S2*）的膜染料的存在使得对与其他关键标记和探针（如荧光蛋白或寡表达抗原）兼容的增殖示踪染料进行选择成为了可能。

结果和讨论

由于PKH26、PKH67和CellVue^® Claret易于使用且可在体外或体内追踪标记细胞的命运（在参考文献⁴中进行了综述），因此它们是研究异质性肿瘤中不同细胞群体是如何影响疾病进展或对治疗进行响应的强大工具。篇幅有限，我们无法对这些试剂自PKH26自1993年问世以来的所有使用方法逐一进行探讨。

追踪抗肿瘤免疫治疗的效果

膜染料最早的应用之一便是作为一种可追踪肿瘤靶标NK细胞杀伤的非放射性探针⁵。正如Zaritskaya近期所综述的那样⁶，该主题在过去的十年内以指数型的速度在延伸。靶标细胞和效应细胞的膜染色标记与多色流式细胞术的结合持续的为信号通路、杀伤机理以及其他影响细胞毒性效应的因素提供详细的见解，无论是在体外^7,8(图2)还是在体内⁹(图S3*)。利用PKH67以及CellVue Claret与可固定的活-死探针相结合的多色细胞毒性实验方法源自于参考文献³中，该文献还对胞啃作用（细胞间通过接触而介导的膜转移）对细胞毒性检测的可能影响也进行了讨论。在另外一项多色应用中，HoWangYin等人¹⁰通过PKH26或PKH27标记的单核细胞对致耐受性抗原（HLA-G1)的胞啃性获取的功能性结果进行了研究。利用表达EGFP标签抗原的PKH26标记M8黑色素瘤细胞，他们发现了一种通过T细胞和单核细胞二者共同介导的高效胞啃作用。然而，来自单核细胞表面HLA-G1更为快速的消失似乎限制了这些自体同源T细胞增殖以及炎症因子产生的能力。

染料稀释增殖分析的应用（图1）在过去的十年里也得到了巨大的扩展。PKH染料以及更新的CellVue Claret¹¹都已在定性和定量监测复杂人群中抗原驱动的细胞分裂中被用作有效的探针。^2,3,12 利用多色流式细胞仪，细胞表面和细胞内的标记均能通过复染以对谱系、激活或分化状态、细胞因子或趋化因子表达、抗原结合能力等与由染料稀释而反映出的细胞分裂程度相关联。特别是，由于我们对于免疫效应和调节细胞相互作用理解的提高以及抗肿瘤疫苗策略的更为复杂全面，染料稀释增殖检测已经能帮助研究人员确定：1）特定的疫苗接种方案是否增加了能够对特定抗原作出反应的前体细胞的频率；2）免疫后前体细胞频率的改变是否或如何与临床反应相关。¹ 在近期一项令人激动的案例中，Barth等人利用PKH67染料稀释分析对利用自体树突状细胞疫苗进行联合治疗之前和之后的结直肠癌病人进行了抗肿瘤T细胞前体频率的测定。¹³

尽管治疗前抗肿瘤T细胞反应的存在于无复发生存期之间不相关，但在接受疫苗接种后1周出现CD4/CD8 T细胞前体频率升高的病人，相比于未出现前体细胞频率升高的病人，具有显著更好的5年无复发生存期（图3）。PKH26染料稀释增殖分析也已被用于研究接受了雄激素剥夺治疗转移性疾病的前列腺癌患者的适应性免疫反应变化。¹⁴ 在开始治疗1个月后，机会所有的T细胞亚群（初始，效应及记忆细胞）中都出现了应对CD3和CD28刺激的增殖性反应增强，而效应细胞和中心记忆亚群中的增强最为明显。

肿瘤干细胞示踪

PKH26、PKH67和CellVue^® Claret一项快速增长的应用是对不同细胞亚群的增殖行为对肿瘤进展以及对化疗或免疫治疗反应影响进行监测。特别是，许多研究人员已在利用未分裂或缓慢分裂的细胞会保持带有膜嵌入染料的明亮标记这一事实，来对低频“标记保留细胞”进行鉴定和分选并用于进一步的表征。同样，篇幅限制了总结的全面性，但近期文献中的几个例子将会被用于说明这种方法的有效性。

无法利用常规的化学疗法而根除上呼吸消化道鳞状细胞癌变的现象已被猜想至少有一部分原因是因为在该亚群细胞恶化和内在抗药的过程中出现了一种类间充质细胞的亚群细胞。在对SCC9鳞状癌细胞用PKH67标记并体外培养9天后，Basu等¹⁵将最明亮的10%（低周转率）以及最暗淡的10%（高周转率）进行了分选并对其E-cadherin的表达进行了比较。与所假设的机制一致，低周转率的亚群细胞相对于高周转率的具有五倍更多的类间充质（低E-cadherin）细胞。基于E-Cadherin表达而进行的分选确认了类间充质亚群细胞（Ki-67表达比例下降的细胞）降低的增殖状况以及在体外对紫杉醇更强的耐药性。Schubert等人¹⁶利用了一种相关的方法来对基于CD34表达、乙醛脱氢酶（ALDH）活性或PKH26标记保留而从AML病人骨髓中分离得到的亚群细胞能引起白血病的能力进行了评估(体外培养5-7天后最明亮的5-10%细胞)。尽管在病人间存在相当程度的变异性，他们还是发现了“筛选出的CD34⁺、ALDH^bright和PKH^bright细胞与AML细胞的生存期以及其在NOD/SCID小鼠的扩大存在关联。在这些研究人员的受众，进行可长期存活细胞筛选的效率与ALDH和CD-34方法相当，但略微却并不显著低于PKH26标记保留方法。

基于膜嵌入染料的长期保留而分选停止或缓慢进行周期的细胞的能力还使得对能促进治疗后肿瘤休眠和最终复发细胞的鉴定和功能表征提供了可能。在一项实例中，研究人员在NOD/SCID小鼠皮下移植3-6周后对PKH26或PKH67标记的A4卵巢癌细胞进行了分离，并筛选出PKH^hi、PKH^neg或PKH^lo亚群细胞（强度分别相当于注射前水平、未染色细胞或中间水平；图4）。通过进一步的表征，非增殖的PKH^hi亚群细胞表现出了许多卵巢癌干细胞预期的特征（图4）。这一观察似乎是普遍性的，因为在衍生自PKH标记A4细胞的恶性腹水及继发性腹膜肿瘤，以及NOD/SCID小鼠中生长出的3周龄C6（衍生自大鼠神经胶质瘤）肿瘤中均发现了类似的表征。两个疗程的紫杉醇治疗导致了PKH^hi（静止）和PKH^lo（停滞或缓慢循环）子集的富集，使得作者得出结论“肿瘤来源的[癌症干细胞]和非整倍体群体促进了癌症进展中的耐药性和肿瘤休眠 。“¹⁷ 来自米兰的研究人员已成功将明亮的PKH26标记的长期保留与体外乳腺球状体培养结合起来用于分离罕见的正常乳腺干细胞（MSC）和乳腺癌干细胞（CSC），并在单细胞水平对两者的生长特性进行了研究。^18,19 对于正常的人MSC，细胞分裂主要是不对称的，通过随后的染料稀释可反映出其中只有一个子细胞会继续分裂，而通过明亮的PKH26标记的保留则反映出另一个子细胞是保持静止的。（图5）。相反的是，无论是致癌性的Erb-B2转化鼠细胞¹⁸还是从病人分离出的CSC¹⁹都展现出了更高数量的对称分裂，即两个子代细胞均继续发生了分裂。源自低分化（3级）乳腺肿瘤的球状体相比于源自分化程度更高（1级）肿瘤的球状体含有更高数量的PKH26^bright肿瘤干细胞。令人激动的是，Pece等人¹⁹与PKH26^bright细胞（hNMSC特征）相关的转录谱分析可用于预测乳腺癌的生物学及分子功能。虽然这项工作并不能直接确定肿瘤起始干细胞的来源，但它确实提出了一种肿瘤进展的模型，其中转化事件可改变干细胞略过不对称自我更新分裂的频率，从而影响了存在于肿瘤内的肿瘤干细胞最终数量，及其其生物学和临床表征。

结论

这里所列举的案例阐明了利用膜嵌入染料PKH26、PKH67和CellVue^® Claret进行细胞、膜或增殖示踪的许多方法中少数几种方法，而它们已被用于免疫细胞对肿瘤的反应、肿瘤细胞对免疫细胞的反应，以及可影响肿瘤休眠和对治疗反应的增殖表征的研究。其他一些近期的文献也将这些试剂应用于研究内皮细胞前体²⁰、静止的造血前体²¹、转染的免疫细胞^22,23、抗原呈递细胞²⁴、调节T细胞²³等。可对几乎任何细胞类型进行标记的能力，结合简易的标记过程以及能在不同荧光波段间进行选择而在多色研究中与其他试剂兼容的能力，表明这些试剂将会持续帮助扩大我们对于肿瘤生物学和抗肿瘤免疫治疗的了解。