利用in situ PLA检测蛋白质间的互作

is PLA – 方案简述

1.组织预处理，以获得最佳抗体性能（如HIER，pH=6）
2。封闭
3。一抗孵育
4.洗涤
5.PLA^®探针孵育，在37 °C孵育60分钟。
6.洗涤
7.连接孵育，在37 °C孵育30分钟。
8。扩增孵育，在37 °C孵育100分钟。
9.洗涤
10.准备成像

使用含DAPI的Duolink In Situ封片剂封固样品。

以下是利用is PLA以及Prestige单抗和多抗检测FFPE人类组织切片中的蛋白质互作的三个实例。

核膜中的Emerin-lamins互作

核膜隔离了细胞核和细胞质，保护细胞核的结构完整性并控制细胞核与细胞质之间的分子通道。⁵Emerin(EMD)是一种内层核膜蛋白，与细胞核的机械完整性和组织特异性基因调控均有关。⁶核纤层蛋白（Lamin）是内层核膜下方核纤层的主要成分。它们作为内层核膜与染色质之间的桥梁⁷，为核膜提供机械支撑、维持合适的染色质组织结构和转录调控。⁸Emerin与Lamin的互作对于维持细胞和完整性具有重要作用。⁹Emerin和Lamin基因突变导致的病理现象被称为“核膜病症”。¹⁰

在此，我们分别使用了抗EMD小鼠单克隆抗体AMAb90560（1:5000，图2 A）和抗LMNA兔多克隆抗体（HPA006660，1:30，未展示）或LMNB1兔多克隆抗体（HPA050524，1:150 图2 B），对复层扁平上皮细胞核膜中的EMD-LMNA（图2 C和EMD-LMNB1（图2 D）互作进行了可视化。位于核膜区域的红色免疫荧光PLA信号（图2 C，D）与IHC染色（图2 A，B）相对应。使用DAPI复染细胞核（图2 C，D）。

上皮细胞膜中的E-cadherin – β-catenin互作

上皮细胞作为渗透屏障，可将其下方细胞与环境隔离。该功能需要细胞之间相互紧密连接。E-钙黏蛋白(E-cadherin，CDH1)是一种能够与β-连环蛋白(β-catenin，CTNNB1) 形成复合物的跨膜蛋白，它对于上皮细胞之间的粘附作用至关重要。钙黏蛋白介导的细胞接触中缺失连环蛋白，是上皮间充质转化(EMT)过程的一个重要因素。^11,12 EMT过程被认为是肿瘤细胞转移扩散过程中的一个重要事件。在该过程中，上皮肿瘤细胞获得了更具活力和侵袭性的表型，并从原发性肿瘤中扩散出来。¹³

在此，我们使用抗CDH1单克隆抗体AMAb90865（1:1000）和抗CTNNB1多克隆抗体HPA029159（1:600）检测正常上皮组织膜中的CDH1- CTNNB1互作，包括前列腺（图3 A）、输卵管（图3 B和结肠（图3 C）。注意上皮细胞（图3 A-C）中的强膜阳性以及扁桃体淋巴组织（阴性对照，图3 D）中的PLA信号缺失。使用DAPI复染细胞核。

肾小球膜中的足萼样蛋白-埃兹蛋白互作

细胞膜含有多种蛋白质，它们参与维持细胞结构、跨膜运输和信号转导等过程。足萼样蛋白(Podocalyxin-like protein，PODXL)是一种具有抗粘附性质的跨膜唾液粘蛋白。在正常肾脏中，PODXL的功能是维持足状突细胞中相邻足突之间的过滤通道处于开放状态。PODXL也被证明与癌症的发展和侵袭性有关^14-17，至少部分原因是它与肌动蛋白结合蛋白埃兹蛋白(ezrin，EZR)之间的互作。^18,19

PODXL和EZR均在正常肾小球膜和输卵管纤毛上皮中表达。在此，我们利用is PLA技术以及PODXL单克隆抗体AMAb90644(1:5000)和EZR多克隆抗体HPA021616(1:2500)证明这些蛋白之间的互作。注意肾小球膜（图图4A，B）和输卵管上皮细胞顶膜（图4 C）中的强PLA信号。肝脏被作为阴性对照（图4 D）。使用DAPI复染细胞核。

总结

本文提供的数据证明了如何利用强大的PLA技术联合Prestige单抗和多抗对人类组织中的蛋白质互作进行原位检测。基于这些数据的研究可以进一步帮助我们了解正常和病理状态下的蛋白质功能。