优化免疫荧光实验方案
获取最优质细胞图像的技巧

荧光显微镜具有光谱激发和发射的独特配置。  该显微镜出厂配有高强度光源，如弧光灯或激光器，用于发射特定波长的光线激发对应的荧光染料。滤光片组可捕获由激发的荧光染料发出的一系列波长光线，光谱范围可扩大以尽量增加可捕获的发射光，也可缩小以提高特异性并减少发射通道的光谱重叠。上表示例是基于常见的荧光显微镜配置。  用户可查询所用仪器的激光器和滤光片配置，在此基础上选择最适合免疫荧光ICC或IHC实验方案的荧光标记抗体。  显微镜中心科学家通常是免疫荧光实验设计的可靠帮手。

荧光染料选择的其他考虑

光稳定性：荧光分子在显微过程中过度暴露于环境光或激发光源会导致光漂白或不可逆的光诱导损伤，影响荧光染料的荧光发射能力。很多通用的荧光染料如FITC和TRITC的广泛供应是由于其非专有性和更长市场寿命，但与使用其他化学法的新一代荧光染料相比，它们可能对光漂白更加敏感。

当制备含有荧光探针的抗体稀释工作液时，可考虑在避光容器中（比如棕色瓶）稀释工作液。工作液通常比储存原液或商品化抗体制剂在光线中暴露更久，因此该额外减少光线暴露的措施可在使用场景中提供更多保护。

荧光保护计划：延长荧光抗体和试剂的使用寿命

为了维持荧光基团的光稳定性及抗体本身的功能完整性，可能需要对荧光试剂采取特别的储存和处理手段。确保试剂在供应商货运文件规定的温度条件下送达，并按照生产商建议转移到实验中正确储存，以免影响光照和温度条件。收到抗体原液后，分装为小容量（作相同标记）可限制原液在冻融循环、冰桶改变等温度变化或环境光线中的暴露次数，从而保护试剂完整性。

光谱重叠：开展多重实验分析同一样品中的多个靶标时，需要考虑荧光染料光谱特性、激光波长和显微镜滤光范围。选择显微镜发射滤光片配置时应尽量减少光谱重叠，选择不具有会漏入相邻滤光通道的长发射光谱“尾巴”的荧光染料。

抗体选择：染色法

抗体选择

直接染色法：某些研究人员可能比较偏好“直接染色”方法的便利性，这种方法将一抗与荧光染料直接偶联，可以一步到位完成结合和荧光检测，而且缩短了IF-ICC实验方案的总时间。  直接标记物还无需选择不同宿主来源的一抗以免交叉反应，方便同一样品多个靶标的多重染色（多重IF-ICC详情如下）。

使用一抗标记物时，染色应在暗处进行，以免荧光染料被光漂白。完成一抗标记物的孵育后，可立即洗涤和封片。可使用抗体混合物一步完成样品中多个靶标的染色。

间接染色法：在“间接”免疫检测中，未标记一抗特异性结合靶标后，紧接着使用针对一抗宿主物种的荧光标记二抗。  该方法具有独特的信号放大优势，因为单个一抗可以结合多个荧光标记二抗，扩大了抗原部位的荧光发射分子数目。

如前所述，采用间接检测法同时分析同一样品多个抗原时，需要考虑额外因素。

抗体选择：靶向，特异反应性

一抗：

进行间接检测时，在多重分析实验的一抗和二抗孵育步骤中均采用多种抗体的混合物。因此必须为各个靶标选择在不同宿主中生产的一抗，  确保在样品中二抗混合物的每种标记抗体都与独有（宿主特异性）的一抗结合。没能为每种靶标抗体选择独有的宿主会导致无法解释的染色结果。  下为多重间接检测实验的设置示例：

本例中，如果研究人员改为选择兔抗B一抗，抗兔二抗标记物将会同时靶向抗A和抗B两种一抗，于是靶标A和靶标B都会标记上绿色荧光信号。

一抗和组织的交叉反应性：  选择间接染色法抗体时，建议不要选择任何在样品来源宿主中生产的一抗，例如，对小鼠组织样品不要选择小鼠一抗。  如果使用了抗小鼠二抗，会导致二抗直接广泛结合组织样品，引起严重的背景染色。尽管售卖的试剂盒都旨在封闭宿主自身反应性，间接法实验风险最低的防范措施还是在选择一抗时就注意避免宿主自身反应。  注意：直接染色法通常没有宿主自身交叉反应性问题。

二抗：

如上所述（抗体选择：染色技术，间接法），“间接”IF-ICC可放大信号，因为与单个靶标结合的一抗可结合多个二抗。采用间接IF-ICC法时，实验室还可建立与不断增长的一抗兼容的二抗模块库，以便任何靶标都能分配到任何可用的显微镜滤光通道。

洗涤：

每次完成抗体或其他荧光探针反应后进行洗涤，可去除样品中的低结合亲和力抗体，从而减少非特异性信号或交叉反应。注意不要夸大洗涤步骤的重要性。  用PBS洗涤数分钟、至少换液一次，有助于去除样品中未结合的和松散结合的抗体。  

延长洗涤时间可能并无明显的背景降低优势，但一般也没什么害处，只要保证在多出的时间中缓冲液不会将样品从载玻片或盖玻片中洗脱。  洗涤时间过短、重复次数变少会不能有效去除非特异性结合靶标的抗体，最终导致较差的信噪比。

细胞核复染和封片：

很多研究人员在开展IF-ICC时都倾向于使用荧光试剂来标记细胞核，比如DAPI或Hoechst。  因为这两种染料都会在到达DNA的数秒内嵌入发出荧光。可使用含DAPI的封片剂一步完成细胞核染色和封片，既能免除DAPI/Hoechst单独染色和洗涤步骤而节省时间，又可缩小细胞核复染的浓度和孵育时间差异。

所有封片剂均可将盖玻片粘附到载玻片上，并保护样品免遭脱水，以便显微镜观察。很多封片剂还优化过显微镜折射率，有的还含有试剂可以保护与染色样品结合的荧光染料，使其免遭光漂白。

IF-ICC的实验对照

同其他实验一样，设置阳性和阴性对照有助于增强ICC荧光结果灵敏度和特异性的可靠性。

IF-ICC的实验对照可包括：

省略一抗：

ICC实验有一个可轻松设置的简单对照是在间接免疫检测方案的一抗染色步骤中省略一抗。用于揭示是否有检测信号是源于荧光二抗与样品的非特异性直接结合。

同型对照：

对于使用标记一抗的直接染色法，用标记相同荧光基团的同型对照取代标记一抗，有助于确保所有检测信号都源自一抗和抗原的特异性结合。同型对照通常由抗体标记物的供应商提供，与针对抗原的抗体属于同一物种和免疫球蛋白类型，但不具有针对任何已知表位的特异性。  同型对照是一抗的对照，它们的加入可以表明检测信号并不是仅仅因为一抗蛋白本身的粘性(stickiness)（带来的非特异性结合）。

目标抗原阴性细胞：

已知不表达目标抗原的某种细胞可用作阴性对照样本。  另外，如有经基因改造无法表达目标蛋白的细胞（敲除细胞）也可作为靶标特异性的有力对照。可采用CRISPR/Cas核酸酶等基因改造技术敲除目标蛋白表达，构建阴性对照细胞系。  

目标抗原阳性细胞：

如有已证明可表达目标抗原的细胞，无论是内源性还是通过修饰“敲入”或过表达基因，细胞都可用作阳性对照，用于确认当靶标存在于样本中时，染色实验方案能产生信号。

获得IF-ICC实验最佳信号和最低背景的专家建议

• 尽可能选择有ICC应用结果数据证明的抗体
• 荧光抗体的光谱特性应适配显微镜的激光器和滤光片
• 待固定的细胞样本应健康、无污染和沉淀并处于亚融合状态
• 固定和透化方法的优化依赖于靶标及其亚细胞位置
• 用封闭液稀释抗体以便在整个染色过程中维持封闭效果
• 间接检测法的荧光二抗可用于信号放大
• 在光谱特性相似的抗体偶联物中选择时，选择最稳定的荧光基团以避免长时间或重复的显微镜暴露造成的光漂白，同时注意避免光谱重叠
• 永远要记得设置适当的染色对照  如有可能，请使用阳性和阴性生物对照。