标准聚合酶链式反应 (PCR) 设置包括四个步骤:
下面将详细介绍这些步骤以及对应的材料和试剂选择要点。以下为使用Taq DNA聚合酶进行的基本PCR方案。
PCR的反应的故障排除涉及到多个因素。观看此动画,了解如何根据需要选择正确的组分循环条件以帮助实现理想的效果。
Taq DNA聚合酶是一种来自嗜热细菌栖热水生菌的热稳定酶。其在PCR 常用于扩增DNA片段。该酶是重组形式,在大肠杆菌中表达。它能够承受反复加热至95°C(PCR技术强制要求)而不会显著损失活性。通过SDS-PAGE测定,该酶约为94 kDa,没有可检测的核酸内切酶或核酸外切酶活性。它具有5'→3' DNA聚合酶活性以及5'→3'核酸外切酶活性。每批Taq DNA聚合酶都经过PCR扩增和双链测序测试。该酶以5单位/μL供应,并配有优化的10x反应缓冲液。
请根据下表选择适合您反应条件的Taq DNA聚合酶混合物。可选择有/无氯化镁(MgCl2)的透明或红色染料配方,预配制readymix,或包含缓冲液和dNTP的预混液。
*可组合购买以下缓冲液和Taq 聚合酶:D1806、D4309或D4545
2.轻轻涡旋混合并短暂离心,收集试管底部的所有组分。
说明:如果使用没有加热盖的热循环仪,则向每个试管的顶部添加50 μL矿物油以防止蒸发。
3.扩增扩增参数会随所使用的引物和热循环仪的不同而不同。可能需要针对具体的引物、模板和热循环仪优化系统。
建议进行25-30个循环的扩增
4.扩增的DNA可以用琼脂糖凝胶电泳和随后的溴化乙锭染色来评估。
说明:可以通过单次氯仿提取(1:1)除去矿物油覆盖层,回收水相。
根据美国专利5,804,375、5,994,056、6,171,785、6,214,979、5,538,848、5,723,591、5,876,930、6,030,787和6,258,569,以及美国以外相应的专利、或者任何其他与5' 核酸酶和dsDNA结合染料工艺相关的专利或专利申请,并未随着售出本产品而转让任何许可。欲悉详情,请联系应用生物系统权利许可主任(Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA)
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