Anti-FLAG^® M2磁珠

• Anti-FLAG^® M2磁珠用于捕获FLAG^®标签蛋白
• 样品制备与亲和纯化
• 电泳和蛋白质印迹分析
• 比较FLAG标签融合蛋白的洗脱方法
• FLAG^®标签抗体、蛋白标准品与亲和纯化工具

Anti-FLAG^® M2磁珠用于捕获FLAG^®标签蛋白

Anti-FLAG^® M2磁珠提供一种简单、便捷的方法，检测和捕获带有FLAG^®肽序列的融合蛋白。这种免疫磁珠是结合Anti-FLAG^®鼠单克隆抗体（克隆号M2）的超顺磁铁包覆的4%琼脂糖微珠。Anti-FLAG^® M2抗体可识别哺乳动物和细菌细胞中表达的融合蛋白N端、Met-N端或C端的FLAG^®八肽序列(N-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-C)。

Anti-FLAG^® M2磁珠结合的融合蛋白可通过多种方法洗脱，包括肽竞争法、酸性法和SDS-PAGE上样缓冲液法。本文对三种洗脱方法进行了比较。使用融合蛋白的质控标准品——FLAG^®-BAP N端融合蛋白(P7582)或FLAG^®-BAP C端融合蛋白(P7457)作为样品，单独孵育或掺入A431细胞裂解物孵育。

结果表明，3X FLAG^®肽(F4799)竞争和酸性pH(2.5-3.0)洗脱法对Anti-FLAG^® M2磁珠的洗脱最为高效。其中，用3X FLAG^®肽洗脱时，样品需与100-150 ng/µL FLAG肽共同孵育30分钟，酸性洗脱时，与0.1 M甘氨酸-盐酸(pH 2.5-3.0)的孵育时间则不到10分钟。实验另证明了这类磁珠不适合碱性洗脱(pH 8-10)，以及延长甘氨酸-盐酸的洗脱时间并不能增加蛋白洗脱量。最后对比分析了使用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱的样品。这种洗脱条件较为简单，但由于上样缓冲液中的SDS造成M2抗体变性，凝胶电泳出现了对应anti-FLAG^®抗体重链和轻链的条带。

样品制备与亲和纯化

充分重悬Anti-FLAG^® M2磁珠(M8823)，取20 µL悬液（包含10 µL磁珠量）分装到几个微量离心管中。管子置于PureProteome™磁力架(LSKMAGS08)上，吸附所有磁珠后去除上清。加入200 µL Tris缓冲盐溶液(TBS)平衡磁珠，待与样品孵育（图1）。

制备样品和免疫沉淀。将FLAG-BAP™ C端融合蛋白或FLAG-BAP™ N端融合蛋白稀释至终浓度0.6 ng/µL（500 µL样品含300 ng蛋白）。另将FLAG-BAP™融合蛋白以同一终浓度掺入A431细胞裂解物，稀释至总蛋白裂解物浓度为1.6 ng/µL。为了维持磁珠的悬液形式并与500 µL样品充分接触，在旋转混合仪上孵育管子3小时至过夜。孵育后，将所有管子置于磁力架上吸附并去除上清，再用500 µL TBS缓冲液洗涤3次。采用三种方法洗脱蛋白：

1. 竞争法洗脱。磁珠中加入50 µL 100 ng/µL的3X FLAG^®肽，在水平摇床上室温孵育30分钟。
2. SDS-PAGE上样缓冲液洗脱。加入20 µL 2X Laemmli上样缓冲液（不含DTT），95°C沸腾10分钟，待用于凝胶电泳。
3. 酸性、碱性洗脱。加入50 µL甘氨酸-盐酸(pH 2.5-3.0)或甘氨酸-氢氧化钠(pH 8.0–10)溶液，在水平摇床上孵育5-30分钟（具体视实验内容而定）。

孵育后，将全部管子置于磁力架上吸附，取上清（洗脱组分）转移至干净的微量离心管中。酸性洗脱样品应立即加入10 µL的0.5 M Tris-1.5 M NaCl(pH 8.0)溶液中和。

电泳和蛋白质印迹分析

4-12% SDS-PAGE凝胶、200伏、30分钟电泳分离样品。考马斯亮蓝染色凝胶或将电泳蛋白转移至Immobilon^®-P PVDF印迹膜上。转移后，用2%脱脂干乳封闭印迹蛋白1小时，再加入封闭缓冲液1:1000稀释的anti-FLAG^® M2抗体(F3165)孵育。用TBST缓冲液洗涤印迹3次，再加入1:50,000稀释的山羊抗小鼠IgG HRP(AP124P)孵育1小时。

检测时，所有印迹加入Immobilon^® Forte Western HRP底物孵育5分钟，再通过数字成像系统获取图像。

比较FLAG标签融合蛋白的洗脱方法

将两种融合蛋白标准品FLAG-BAP™（N端）和FLAG-BAP™（C端）以及掺入FLAG-BAP™（N端）的A431细胞裂解物与anti-FLAG^® M2磁珠孵育结合，再采用三种洗脱方法洗脱。如图2所示，三种方法均能有效洗脱蛋白，但SDS上样缓冲液洗脱后出现了对应anti-FLAG^® M2抗体重链和轻链的额外条带。

用甘氨酸-HCl(pH 2.5-3.0)和甘氨酸-NaOH(pH 8-10.6)洗脱8个A431细胞裂解物样品（掺有FLAG-BAP™ N端融合蛋白标准品）。通过电泳和电转印分离洗脱组分。结果表明，anti-FLAG^® M2磁珠仅可在酸性条件下洗脱（图3）。

为了证明酸性洗脱与磁珠的孵育时间无需长过10分钟，采用0.1 M甘氨酸-盐酸溶液（pH 2.5、2.8和3.0），对不同样品进行不同时间的洗脱孵育。图4表明，蛋白得率与孵育时间无关，并与3X-FLAG肽竞争法洗脱相近。