使用Sephadex^®进行分离

每个样品的脱盐和缓冲液置换过程可能不到5分钟，并且大多数蛋白质的回收率大于95％。

为了防止可能的离子相互作用，建议在脱盐期间和最终样品缓冲液保持低盐浓度（25 mM 氯化钠）。如果需要避免氯化钠存在，可以使用挥发性缓冲剂，例如100 mM乙酸铵或100 mM碳酸氢铵。

该过程需确保样品应完全溶解。离心或过滤以去除颗粒物（附录3）。始终使用脱气缓冲液避免将空气引入层析柱。

使用普通水性缓冲液时，只要蛋白浓度不超过70 mg/mL，样品浓度就不会影响分离。

如果可能，请使用配有UV和电导率监测器的色谱系统，促进样品进样优化。可以准确跟踪A₂₈₀处的蛋白质峰洗脱以及是否出现盐峰，并可以轻松比较不同的分离，如图 5.6 所示。

如果无法监测电导率且主要要求回收完全脱盐的样品，则所用样品体积相当于柱体积15%至20%。

一般注意事项

样品的小规模脱盐

对于0.2 -2.5 mL的样品体积，可以使用PD-10脱盐柱、PD MidiTrap™ G-25和PD MiniTrap™ G-25脱盐柱平行处理多个样品。这些脱盐柱具有两种操作方案：一种用于实验台手动操作；另一种用于标准离心机和离心接头的组合。对于较小的蛋白质 (M_r > 700)，可使用PD MiniTrap™ G-10和PD MidiTrap™ G-10 脱盐柱。

对于70-130 µL的较小样品体积，可以使用PD SpinTrap™ G-25离心柱及微量离心机或PD PD MultiTrap™ G-25 96孔板的组合进行离心萃取。尽管操作上可行，但不建议在负压条件下使用 PD MultiTrap™ G-25脱盐柱，因为这种方法的重现性相对于离心法更低。

使用HiTrap^®和HiPrep™ 脱盐柱对较大体积样品进行脱盐

最多连接5个5 mL的HiTrap^®脱盐层析柱，以增加样品容量，例如，两个脱盐柱串联可容纳的样品体积为3 mL；三个脱盐柱串联可容纳的样品体积为4.5 mL。

最多连接4个HiPrep 26/10脱盐柱，以增加样品体积容量，例如：2个柱子可上样样品体积为30毫升，4个柱子的可上样样品体积则为60毫升。即使使用四个脱盐柱串联，也依然可以在20-30分钟内完成样品处理。

缓冲液制备

对于具有带电基团的物质，建议使用含有缓冲盐的洗脱液。建议盐浓度至少为150 mM，以防止可能与色谱介质发生离子相互作用。通常可以使用氯化钠。一般来说，缓冲液中的缓冲物质浓度为25-50 mM即可。当盐浓度高于1 M时，疏水性物质可能延迟洗脱或与色谱介质结合。

在更高的盐浓度（高于1.5 M硫酸铵）下，脱盐柱介质会收缩。

样品制备

只要样品与所用缓冲液的粘度相差不超过1.5倍，样品浓度就不会影响分离效果。使用正常的水性缓冲液时，该粘度相当于最高蛋白质浓度70 mg/mL。样品应完全溶解。如有需要，可在上样前离心或过滤（0.45 µM过滤器），以去除颗粒物。

缓冲液置换

蛋白质溶解度通常取决于pH和/或离子强度（盐浓度），因此，缓冲液置换可能导致蛋白质沉淀。此外，如果pH变化至超出蛋白质活性范围，则可能损失蛋白质活性。纯化后的样品通常不含颗粒，除非纯化后的蛋白质或污染物聚集。

下述方案描述了使用不同形式预装柱进行的脱盐和缓冲液置换。

HiTrap^®脱盐柱

HiTrap^®脱盐柱是一种采用SEC介质Sephadex™ G-25 Superne（基于交联葡聚糖珠）填充的5 mL柱（图5.7）。该脱盐柱对球状蛋白质的分离范围介于 M_r 1000- 5000之间，排阻极限约为M_r 5000。这确保脱盐柱可对分子量大于Mr 5000的蛋白质/多肽与分子量低于M_r 1000的分子实现分组分离。

HiTrap^®脱盐柱可与pH范围为2-13的水溶液一起使用。预装介质可在所有常用缓冲液、尿素溶液（8 M）、盐酸胍（6 M）以及所有非离子和离子去污剂中保持稳定。缓冲液或样品中可使用低碳醇（甲醇、乙醇、丙醇），但是我们建议将浓度控制在25% v/v以下。应避免长时间暴露（几小时）于pH值低于2或高于13的环境，或者氧化剂。当

需要完全去除低分子量组分时，建议样品体积范围为0.1-1.5 mL。当流速在1-10 mL/min范围内时，分离效果不受流速影响。建议的最大流速为15 mL/min。使用进样针、泵或色谱系统，可轻松完成分离。最多可以串联三个脱盐柱，以便处理更大的样品量。为避免交叉污染，仅能使用与样品类型相同的脱盐柱。

使用进样针手动纯化

1. 在进样针中注入结合缓冲液。为避免将空气引入脱盐柱，通过"点接触"将脱盐柱连接至加样针（利用随附的连接器）。
2. 掰断脱盐柱出口处的可折断端
3. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡脱盐柱。
4. 使用安装在色谱柱鲁尔连接器上的进样针添加预处理样品。为实现最优效果，上样过程中使用 0.2 至 1 mL/min（1 mL脱盐柱）和 0.5 至 5 mL/min（5 mL脱盐柱）的流速*。
5. 用 5 至 10 倍柱体积的结合缓冲液洗涤，或洗涤至流出液中无物质出现。洗涤时保持 1 至 2 mL/min（1 mL 脱盐柱）和 5 至 10 mL/min（5 mL 脱盐柱）的流速。可选：收集流出液（1 mL脱盐柱为 1 mL 组分，5 mL脱盐柱为 2 mL 组分）并保留，直至操作步骤成功完成。保留样品进行 SDS-PAGE 分析，以测量蛋白质与介质结合的效率。
6. 用 5 至 10 倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱时保持 0.2 至 1 mL/min（1 mL 脱盐柱）和 0.5 至 5 mL/min（5 mL 脱盐柱）的流速。
7. \洗脱后，用 3 至 5 倍柱体积的结合缓冲液洗涤脱盐柱以再生柱。现在该脱盐柱即可重新进行脱盐纯化。

* 使用HiTrap^® 1 mL脱盐柱和进样针时，1 mL/min 相当于大约 30 滴/分钟； 使用HiTrap^® 5 mL脱盐柱时，5 mL/min 相当于大约 120 滴/分钟。

对于大体积样品，可以使用蠕动泵添加样品和缓冲液。