如何识别、找出和纠正最常见的HPLC问题
尽管色谱柱技术和仪器的发展改进了HPLC方法，但仍然存在问题。在本指南中，我们为您提供了找出、识别和纠正诸多常见HPLC问题的系统方法。
无论您使用模块化系统还是使用更精密的设备，HPLC系统的重要组成部分都是相同的。每个组件都可能出现影响总体系统性能的问题。本指南讨论了一些常见问题。本指南以易于使用的表格形式说明了这些问题的解决方案。
找出HPLC问题
在HPLC系统中，引起问题的来源很多。首先界定问题，然后从源头上杜绝问题。
使用表1确定是哪个或哪些组件造成的问题。通过排除法，通常可以帮助您查明具体原因并纠正问题。
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如何防止流动相问题
色谱图灵敏度低，基线上升、噪音、尖峰等通常因流动相所致。在梯度洗脱中，流动相中的污染物特别麻烦。它们可能会使基线上升，随着受污染的组分增加，可能出现伪峰。
水是反相分析中最常见的污染源。在配制流动相时，只能使用高纯度的蒸馏水或去离子水。然而，几种常见的脱离子剂会将有机污染物带入水中。要去除这些污染物，让去离子水通过活性炭或制备型C18柱。
仅使用HPLC级溶剂、盐、离子对试剂和酸碱改性剂。清洁质量较低的溶剂非常耗时，通常会残留痕量的污染物。使用高灵敏度UV或荧光检测器时，这些痕量污染物可能会导致问题。
因为许多水相缓冲液会促进细菌或藻类的生长，所以应新鲜制备这些溶液，并在使用前进行过滤（0.2 μm或0.45 μm过滤器）。过滤还能够去除可能产生基线噪音或堵塞色谱柱的颗粒。通过向水相缓冲液中加入约100 ppm的叠氮化钠来防止微生物生长。也可将这些缓冲剂与20％或更高的有机溶剂（例如乙醇或乙腈）混合。
为防止系统中出现气泡，对流动相溶液脱气。通常首选在线脱气机，但如果流动相不含任何挥发性成分，则可以选择使用喷氦脱气。
小心使用离子对试剂。每次分析必须确定最佳链长和试剂浓度。浓度可低至0.2 mM，或高至150 mM或更高。通常，增加浓度或链长会增加保留时间。高浓度（> 50％）的乙腈或一些其他有机溶剂会沉淀离子对试剂。离子对试剂有些盐不溶于水并会沉淀。在存在长链磺酸（例如十二烷基硫酸钠）的情况下，应避免这种情况，用含钠缓冲液代替含钾缓冲液。
当您希望回收化合物用于进一步分析时，挥发性酸碱改性剂（例如三乙胺（TEA）和三氟乙酸（TFA））是有用的。这些改性剂还可以避免与离子对试剂相关的问题。它们还可以0.1至1.0％TEA或0.01至0.15％TFA的浓度添加至缓冲液中。增加浓度可以改善某些化合物的峰形，但会改变保留时间。
近年来，越来越广泛地回收用于等度分离的流动相，作为降低溶剂成本、处理成本和流动相制备时间的手段。溶剂回收器具可利用微处理器控制的开关阀，在检测到峰值时将溶剂流引导至废液箱。当基线低于所选阈值时，未污染的溶剂被引导回溶剂瓶。
图 A.HPLC系统的组成部分
隔离泵问题
泵必须在各种条件下向色谱柱提供恒定的溶剂流量。现代HPLC泵采用单活塞或双活塞、注射器或隔膜泵设计。
泵系统问题通常易于发现和纠正。一些较常见的问题包括色谱图中保留时间不稳定，基线噪音或尖峰。泵配件或密封件泄漏会导致色谱分析不良。泄漏的确切迹象是在泵连接处有盐析出。应每天用新鲜的去离子水 从系统中冲洗缓冲盐。要找出和修复与设备相关的特定问题，请参阅操作手册中的故障排除和维护部分。需要定期更换泵密封件。应定期进行维护，而不是等待问题发生。
进样器和进样溶剂
进样器可快速地将样品导入系统，对溶剂流的干扰最小。HPLC系统目前采用可变环、固定环和针式进样器。进样器有手动、气动或电动驱动选择。
进样器的机械问题（例如，漏液、毛细管管线堵塞、密封件磨损）易于发现和纠正。使用柱前过滤器可防止因进样器密封件的物理老化而导致的色谱柱筛板堵塞。不可再现进样等其他问题，则较难解决。
定量环未完全填充、进样溶剂与流动相不相容或样品溶解度差，均可能导致峰高易变、裂峰和宽峰。尽可能在流动相中溶解和注入样品。否则，应确保进样溶剂的洗脱强度低于流动相（表3）。请注意，某些自动进样器使用单独的针筒清洗液。确保清洗液与流动相兼容且比流动相弱。在反相和正相分析之间切换时，这一点尤为重要。
色谱柱保护
虽然流动相入口过滤器、进样前过滤器、柱前过滤器、以及保护柱不属于大多数设备的必备部件，但它们大大减少了与复杂分离相关的问题。我们建议让所有样品经过0.45 μm或0.2 μm针筒过滤器过滤。我们强烈建议使用保护柱。
过滤器和保护柱可防止颗粒和强保留化合物积聚在分析柱上。这些一次性产品的使用寿命取决于流动相成分、样品纯度、pH值等。当这些装置被颗粒污染或堵塞时，压力增加，峰值变宽或分裂。例如，图B给出了使用保护柱的示例。
图 B.Supelguard柱延长分析柱的寿命
解决检测器问题
检测器问题分为两类——电气和机械/光学问题。如有电气问题，请联系仪器制造商。机械或光学问题通常因流动池所致。与检测器相关的问题包括漏液、气泡和流通池污染。这些通常会引起色谱图出现尖峰或基线噪音或低灵敏度。
某些流通池，尤其是用于折射率检测器的流通池，对压力敏感。超过制造商建议的流速或背压将破坏流通池窗。旧灯或坏灯以及不正确的检测器上升时间、增益或衰减将降低灵敏度和峰高。电缆连接错误或反接也可能是导致问题的根源。
色谱柱恒温箱、记录器
这些组件很少会导致系统出现问题。我们将在故障排除表（表1）中详细讨论这点。
保留准确的记录
大多数问题不会一夜之间发生，而是有个发展的过程。准确地保存记录对于发现和解决许多问题来说至关重要。
评估您所收到的每个色谱柱，并在日后进行定期评估。通过保存色谱柱柱效、所使用的流动相、灯电流、泵性能等的书面记录，您可以监控系统的性能。
记录还有助于防止错误，例如将水导入硅胶柱，或因添加过多的有机溶剂而使系统中的缓冲液发生沉淀。许多分析员会对HPLC系统做一些修改。可靠的记录是确保修改不会导致问题的最佳方法。与泵、检测器、自动进样器和数据系统相关的问题，请参阅仪器手册的故障排除指南。
HPLC问题索引
进一步的建议
我们建议您参考仪器手册的维护和故障排除部分。现代HPLC系统通常具有自诊断功能，有助于确定仪器的故障区域。对于色谱柱或特定分析中无法消除的问题，请联系Supelco技术服务门。
本指南的其余部分概述了在解析度、保留或选择性丧失后再生色谱柱的步骤，有关如何防止和解决色谱柱硬件问题的建议，以及Supelco产品目录中的色谱柱保护产品。请参阅我们的产品目录，了解我们的全套配件，这些配件可延长色谱柱的使用寿命，通常可简化或改进您的HPLC或FPLC®分析。
最后，您可致电我们索取有关HPLC和FPLC产品的更多资料，或使用我们的ChromFax服务直接查阅我们的所有免费技术资料。
恢复色谱柱的性能
应遵循以下流程恢复因样品污染而导致性能下降的色谱柱的性能。
将色谱柱断开并反转。将色谱柱与泵连接，但不接检测器。遵循此表中的相应冲刷程序，所使用的流速应能产生1500-4500 psi的色谱柱背压，但不得高于制造商使用指南中建议的最大压力。如果您使用SUPELCOSIL色谱柱，则用测试混标和数据表中规定的条件进行分析。柱效、对称性和容量不得超过测试数据表规定的值的10-15％。如果不在该范围内，则重新填充色谱柱入口或更换色谱柱。
注意：表2中列出的体积适用于25 cm x 4.6 mm内径、柱体积为4.15 mL的色谱柱。再生长度小于或大于25 cm的4.6 mm内径色谱柱时，应将表2中的所有体积乘以色谱柱长度与25的比值（例如，对于15cm色谱柱：将表2中体积乘以15/25或0.6）。再生内径不是4.6mm的色谱柱时，应将表2中的所有体积乘以色谱柱内径平方与(4.6)2的比值（例如，对于3.2mm内径的色谱柱：(3.2)2/(4.6)2 = 10.24/21.16 = 0.48 乘以表2中的值）。
暴露于极性溶剂的非键合二氧化硅色谱柱
含有极强极性溶剂（如水或醇）的样品和流动相会使未涂覆硅基HPLC色谱柱失活。这会极大地影响色谱柱性能，特别是溶质保留和选择性。（图C2）。即使使用非极性溶剂长时间冲刷色谱柱，也只能部分地再生色谱柱性能，并且浪费化学品。二氧化硅再生溶液通过去除所吸附的极性物质，经济而快速地再生二氧化硅色谱柱的性能。将溶液以4mL/分钟的速率泵入受影响的相应色谱柱10分钟，然后用流动相以2mL/分钟的速率冲刷10分钟。使用用于评估二氧化硅色谱柱的测试混标（货号58281）评估色谱柱性能。性能应与导入极性溶剂之前的性能基本相同（图C3）。
二氧化硅色谱柱再生溶液，200 mL（货号33175）
图 C.再生溶液再生二氧化硅色谱柱性能
色谱柱测试混标
HPLC色谱柱的性能评估混标。
良好的测试混标能够助您排除色谱问题，优化系统效率，并在了解其性能的条件下评估色谱柱。我们供货是将测试混标装在琥珀色安瓿中，以防止光降解，并提供正确使用指南和结果说明。
可选用色谱柱或应用专用混标。关于我们的各类测试混标，请查看我们的产品目录，或致电我们的技术服务部门。
预防和解决常见的硬件问题
预防漏液
漏液是HPLC分析常见的问题。为最大程度减少系统漏液风险，请勿互换不同制造商的五金件和接头。不兼容接头最初可能强制装配，但在分离时可能出现问题，反复连接后最终导致接头漏液。如果不得不互换，请在操作之前使用适当的转接头并检查所有连接处是否漏液。
高浓度盐（> 0.2 M）和腐蚀性流动相会降低泵密封的有效性。进样器转子密封件的寿命还取决于流动相条件，特别是在较高的pH值下操作时。在某些情况下，长时间使用离子对试剂对泵活塞虽具有润滑作用，但这可能会导致密封件轻微漏液。某些密封件在特定溶剂中表现不佳。在不利条件下使用泵之前，请参阅仪器制造商的规格。如要更换密封件，请参阅泵使用手册的维护部分。
清理色谱柱筛板的堵塞物
色谱柱筛板堵塞是另一个常见的HPLC问题。为从一开始就最大限度减少此问题，请使用柱前过滤器和保护柱。
如要清洁入口，请将色谱柱断开并反转。将其与泵连接（但不连检测器），并以标准流速的两倍泵送溶剂。约5-10倍柱体积的溶剂足以去除入口处筛板上的少量颗粒物。使用标准测试混标评估已清洁的色谱柱的性能。
更换色谱柱入口处的筛板
有时溶剂冲洗（见上文）和再生程序（见表2）都不能恢复色谱柱的性能。如果您已确定问题源于色谱柱，且其他再生程序都已失败，则可能填料有空洞或入口处筛板一直堵塞。
作为最后的手段，打开色谱柱的入口端。注意：打开入口端，以及打开出口端，可能会永久性地损坏填料层。在打开色谱柱之前，请参阅制造商的资料。（切勿打开树脂填料色谱柱的任何一端）。
按照以下程序打开色谱柱。
- 从系统上断开色谱柱。为防止填料从色谱柱中渗出，请尽快执行后续步骤。
- 使用虎钳和扳手或两把扳手小心地拆下入口端接头（参见图D）。如果筛板留在接头中，则在硬表面上敲击接头把筛板敲出来。如果筛板留在色谱柱上，则将其滑下来，而不是向上提下来。这有助于保持填料层的完整性。
模块化色谱柱可能需要特殊工具（例如，货号：55216）来移除筛板盖。 - 检查旧筛板。将筛板压在不锈钢管上会在正确安装的筛板的色谱柱一侧的边缘上留下一个环。如果没有环，可能意味着套圈太靠近管的末端。由此导致的松动连接可能会泄漏二氧化硅，或者起到一个混合室的作用。
- 检查填料层。如果填料层塌陷或断裂，则需要更换新的色谱柱。
- 更换筛板。
- 更换端部接头。用手拧紧，然后用扳手拧紧1/4圈。
图 D.典型的HPLC色谱柱设计
通过去除溶剂和其他流动相组分中的颗粒和气体来保护仪器和色谱柱。尼龙66滤膜过滤器与HPLC中常用的所有溶剂相容。
过滤装置1
（连接至1000 mL的侧臂烧瓶）
包括250 mL玻璃储液罐、漏斗底座和塞子、夹具、不锈钢换膜过滤器和滤网、10个特氟龙垫片、50个尼龙66过滤器（47 mm, 0.45 μm孔）
过滤装置2
（连接到吸取管线）
包括250 mL玻璃储液罐，34/45锥形漏斗底座，34/45 1000 mL锥形烧瓶和玻璃盖、夹具、不锈钢换膜过滤器和滤网，10个Teflon垫片，50个尼龙66过滤器（47 mm，0.45 μm孔）。
过滤器
柱前过滤器对于保护HPLC色谱柱不受颗粒物质的影响至关重要，这些颗粒物质会积聚在色谱柱筛板上，导致裂峰和高背压。颗粒来源包括流动相（特别是当缓冲液与有机溶剂混合时）、泵和进样器密封以及样品。使用2.0μm筛板来保护含有5μm或更大颗粒的色谱柱，或使用0.5μm筛板来保护粒径小于5μm的色谱柱。
Supelco过滤器
直接连接；保护分析柱和保护柱。
我们的柱前过滤器可以直接手动连接到我们当前产品目录中列出的所有HPLC色谱柱或保护柱，或与任何其他具有Valco兼容端接头的色谱柱连接。PEEK盖和柱体，2μm不锈钢筛板。对于无金属系统，请订购PEEK/特氟隆备用筛板（货号57430-U）。
Valco 柱前筛板和筛滤器3
在线安装。高效、低死体积的过滤器保护色谱柱免受颗粒影响，同时不会降低色谱柱性能。可更换的1/8"筛板孔径为0.5μm，用于保护3μm或5μm的色谱柱填料，可更换的滤网孔径为2μm。选用筛板过滤器有助于获得更高的过滤能力（适合大多数应用），选用筛滤器则有助于减少死体积（例如使用微径柱）。使用1/16“外径管，含1/16“接头。
分离技术的柱前过滤器
在线安装。 大容量入口过滤器最大限度地减小死体积和谱带变宽，从而在保护色谱柱的同时防止柱效降低。筛板孔隙率：0.5μm。如图所示完成。
SSI高压柱前过滤器
在线安装。316不锈钢过滤盘（0.5μm孔径）易于更换，无需拆下柱端接头。最大工作压力：15,000 psi (1054 kg/cm²)。适用于1/16“管。
SSI高压进样器前过滤器
SSI高压进样器前过滤器 安装在泵和进样器之间，对流动相进行最终过滤。可轻松更换的316不锈钢过滤元件（0.5μm孔）。最大工作压力：15,000 psi (105MPa)。对于1/16“外径管，10-32螺纹2。
Upchurch柱前过滤器
在线安装。不锈钢壳体，配备惰性聚醚醚酮（PEEK）端接头，一端接头配有0.5μm或
2μm PEEK筛板。
Rheodyne 7725型和7725i型进样器
Rheodyne 7725型进样器可以精密准确地注入1μL-5 mL样品。该进样器坚固耐用，易于维护，具备诸多高级功能：
- 获得专利的连续流设计（见图） - 在从上样（LOAD）至进样（INJECT）切换时保持流动的连续性。
- 用进样器前端压力调节螺丝可轻松调节密封。
- 较宽的端口角度（30度），易于与接头连接。
进样器配备20μL定量环，并配有可由Tefzel转子密封替换的VESPEL转子密封，能够在pH 0-14下操作。出厂设置为5000 psi（345 bar），可调节至7000 psi（483 bar）。7725i型内置位置传感开关。
7725型进样器减少色谱柱的磨损
传统的HPLC阀门会在进样时暂时中断流动，使色谱柱受到双重压力冲击。Rheodyne的不断流 (MBB) 专利设计，可以在断开旧的连接之前进行新的连接，从而保持流动的连续性。
优化技术泵备用零件
实施预防性维护计划，定期更换易磨损的泵部件，可助您避免代价高昂的停机。我们范围广泛的优化技术单向阀、密封件和活塞达到或超过了泵制造商的规格要求。有关最新泵零件，请参阅当前的Supelco产品目录，或致电我们的技术服务部。
SSI LO-Pulse阻尼器
脉冲阻尼器控制泵脉动以获得更稳定的基线。SSI LO-Pulse阻尼器已获专利，与单活塞往复式HPLC泵（Altex 110A、Eldex泵、LDC VS小型泵、SSI 200和SSI 300等）兼容。在500 psi至6000 psi（35-420 kg/cm²）的压力下，它可提高定量分析的精确度和痕量样品组分的检测极限。产品含接头和操作指南。
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