用工程质粒转化大肠杆菌

• 制备感受态细胞
• 制备琼脂板
• 细菌转化
• 收集菌落
• 冻存细菌

制作感受态细胞（Inoue法）

Inoue及其同事在1990年开发了该方法。它非常适用于克隆中常用的许多菌株。起初的方法要求在18 °C下培养过夜的大肠杆菌培养物。我们发现如果它们在37 °C下过夜生长也能得到很好的效果。或者，您可以购买即用型的化学感受态细胞或电感受态细胞，包括BL21（货号CMC0014）和SIG10（货号CMC0001）。商购的现成感受态细胞具有优势，因为它们的制备已经过优化，为独特应用提供具有高转化效率的特化细胞。

您将需要：

DMSO（二甲基亚砜）（货号D8418）
用于培养大肠杆菌的LB板 用于培养过夜培养物的3 × 250 mL（货号H8032） 用作起始培养物的额外SOB 震动培养箱 0.5 M PIPES (哌嗪-1,2-双[2-乙磺酸]) pH 6.7（货号P8203） Inoue转化缓冲液 无菌微量离心管 无菌离心管，容量至少250 mL 能够以2,500 × g的力旋转这种管的离心机

热休克感受态细胞生产实验方案

第1天

1. 从已孵育过夜的LB板中挑选单个大肠杆菌菌落。在含有菌落的50 mL管中接种2 ml SOB培养基的起子培养物，并在37 ℃下震动孵育约7小时。
2. 制备或解冻Inoue转化缓冲液的等分试样。
3. 接种含有250mL SOB培养基和三种不同体积的起子培养物的三个烧瓶，以确保其中一个在第二天早晨达到所需的OD。我们建议尝试10 μL、50 μL和250 μL。将烧瓶在37 °C下震动孵育过夜。

第2天

1. 第二天早上读取所有三种培养物的OD600。继续监测OD600。
2. 当其中一种培养物的OD600达到0.55时，将该培养物转移到冰水浴中10分钟。 （开始冷却微量离心管。）
3. 2,500 x g、4℃离心10分钟收获细胞。
4. 倒掉上清液，将细胞转移到80 mL冰冷的Inoue转化缓冲液中轻轻重悬细胞。
5. 2,500 x g、4℃离心10分钟回收细胞。
6. 倒掉上清液，将细胞移液到10 mL冰冷的Inoue转化缓冲液中轻轻重悬细胞。
7. 加入0.75 mL DMSO，旋转混合，将细胞在冰上静置10分钟。
8. 将100 μL等分的细胞悬液分配到冰冷的微量离心管中。
9. 将等分的感受态细胞分批放入液氮中快速冷冻。

将等分试样储存在-80 °C冰箱中直至需要。

制备琼脂板

该配方设计用于制备约50-60个Luria-Bertani（LB）琼脂板，用于用标准质粒培养大肠杆菌。或者，您可以购买预先测量的EZ-Mix™形式LB琼脂，货号L7533。

10 g胰蛋白胨（货号T2559)
5 g 酵母提取物（货号Y1625，Y1626） 10 g NaCl（货号S3014） 15 g琼脂粉（货号L2897） 用水定容至1升

量出上面的量，添加到带有良好工作盖的1升的瓶子（见下文）。加入干净的去离子水（理想情况下至少18兆欧）。拧紧盖子，摇动混合液体和粉末，不要希望完全溶解，但只要瓶底没有粉末，且液体里没有成团粉末就行。如果没有适当混合，瓶底粉末可能会被烤干。拧松盖子约半圈，缠上高温高压灭菌带，然后高温高压灭菌。

高温高压灭菌后，确保盖子完全拧紧，请勿冷却到45-50度以下。琼脂通常会在40度左右凝固。我们的经验是，如果拿起来不烫手，即可以倒出了，而且实际可能已经太凉了。当琼脂太热时，请勿添加抗生素，否则会影响抗生素的稳定性和半衰期，特别是氨苄西林。加入适量的抗生素（见下文），轻轻旋转混合。避免有气泡，因为这会导致培养板含有气泡或不均匀。每个板大约浇注12-15mL（货号Z617636）。一种简单的方法是将板子摞起来，大的截面（盖子）竖起来。拿着最底下那块板的盖子将摞在一起的所有板子提起来，用另一只手倒琼脂。倒入足够充满底部的量，然后再多倒一点。然后将这摞板放下，然后拿着这摞板的第二个盖子将这摞板子提起进行浇注。这样做看起来很不均匀，但随着时间推移，这其实非常可再现。

或者，您可以购买含有或不含抗生素的现成的LB琼脂板：

LB琼脂板（货号L5542）
含有氨苄霉素的LB琼脂板（货号L5667）
含有卡那霉素的LB琼脂板（货号L0543）
含有羧苄青霉素的LB琼脂板（货号L0418）
含有四环素的LB琼脂板（货号L8795）

提示1：许多实验室瓶子都有蓝色或透明的塑料突边，它们有可能缺失或被火烧焦。当浇注板时，这些蓝色突边防止琼脂从瓶壁流下，并在高温高压灭菌后保持气密。确保突边完好无损。

提示2：1升是相当多的琼脂和抗生素，可按您的需要缩小配方。我一般每次制作0.5升（约30个板）。

抗生素浓度：

在水中制备原液：每1 mL培养基添加1 µl 卡那霉素（货号K4000）— 原液50mg/mL，终浓度50 µg/mL
氨苄霉素（货号A9518）— 原液100mg/mL，终浓度100µg/mL 链霉素（货号S6501）— 原液50mg/mL，终浓度50µg/mL 奇霉素（货号S9007）— 原液100mg/mL，终浓度100µg/mL

在乙醇中制备原液：每ml培养基添加5 µl 氯霉素（货号C0378）— 原液34mg/mL，终浓度170µg/mL
四环素HCL（货号87128）— 原液10mg/mL，终浓度50µg/mL

细菌转化

将DNA导入细菌的最简单方法是热休克和电穿孔。热休克的原理正如其名，是用热使细菌休克。如果不能造成休克，则不起作用，因此之前必须保证细菌是冷的。这个要求怎么强调都不过分。当细菌从冷变热时，它的细胞膜上会形成孔，从而使DNA进入细胞。电穿孔的原理类似，但只是用电打孔。这些过程均是模仿或至少基于细菌的自然能力过程。通常，电穿孔产生更多的菌落，但并非总是如此。对于大多数DNA克隆应用，热休克都好用。

细菌转化热休克实验方案（常用方法）

1. 每次在冰上进行DNA /连接反应或对照反应，都解冻一管预制的感受态细胞，并将管深深地推进冰里。解冻需要大约5-10分钟。保持细胞尽可能冷，避免手接触到管内装着细胞的那部分管身，即使少量的热量也会影响转化过程。
2. 在冰上预冷15 mL Falcon管（货号SIAL0791），将3-4 μL连接反应物（或对照反应物）转移到每个管中。
3. 在每个连接反应中加入95 μL感受态细胞，在冰上至少孵育20分钟。更长时间没问题，但我们只测试了最长至45分钟。
4. 在加热块或水浴中在42 °C下热休克90秒。
5. 然后加入1 mL不含抗生素的LB肉汤（货号L3022、L2542或L3522）或者SOC培养基（货号S1797），并将细胞在37 ℃、227RPM的培养摇床中孵育1小时。
6. 将含有转化后的感受态细胞的所有LB倒在含有正确抗生素的琼脂板上。
7. 将板竖直放置于1级罩内或者37 °C培养箱中，盖子微启，晾干约5-10分钟。请勿在用于哺乳动物组织培养的罩子中执行这一操作。请勿让板干燥时间过长，否则有些细菌可能会死亡。
8. 将平板在37 °C过夜孵育。即将出现的菌落来自单个转化细胞，并且由于存在质粒而对抗生素具有抗性。每个菌落将包含数同一个细胞的百万个相同拷贝，因此称为克隆。

细菌转化热休克实验方案（其他方法）

1. 每次在冰上进行DNA /连接反应或对照反应，都解冻一管预制的感受态细胞，并将管深深地推进冰里。不要只是把管放在冰上或冰中，而是使管尽可能地冷。解冻需要大约5-10分钟。避免手接触到管内装着细胞的那部分管身，即使少量的热量也会大大影响转化过程。
2. 向100μL感受态细胞中加入2-5 μL每种连接反应物（或对照反应物）。将混合物移出时，要用吸吸头非常快速地搅动。请勿上下移液。尖端可能处于室温，因此应尽快将其拿出来。
3. 在冰上孵育至少15分钟。更长时间没问题，但我们只测试了最长至45分钟。
4. 在加热块或水浴中在37 °C下热休克3分钟。
5. 然后加入1 mL不含抗生素的LB培养基（货号L3522、L2542或L3022），并在37 °C下将细胞再孵育15分钟。
6. 将含有转化后的感受态细胞的所有LB倒在含有正确抗生素的琼脂板上。
7. 将板竖直放置于1级罩内或者37 °C培养箱中，盖子微启，晾干约5-10分钟。请勿在用于哺乳动物组织培养的罩子中执行这一操作。重新盖上盖子，当平板接近干燥时，将其翻过来。请勿让板干燥时间过长，否则有些细菌可能会随琼脂干燥而死亡，而你最终得到的是一张非常薄的琼脂片！
8. 将平板在37 °C过夜孵育。即将出现的菌落来自单个转化细胞，并且由于存在质粒而对抗生素具有抗性。每个菌落将包含数同一个细胞的百万个相同拷贝，因此称为克隆。

挑选细菌菌落

这个步骤很简单，因此不需要单独出一份实验方案，但鉴于它是整个过程的一个重要部分，我们在这里简单描述一下。

在进行了有适当对照的转化之后，您应该有三个细菌板。如果一切都正确，您应该在连接板上有很多菌落，而在没有片段但有连接酶的板上有较少的菌落（或没有菌落），在没有片段和连接酶的板上菌落会更少（或没有菌落）。在对照板上背景通常相当高，这并不一定意味着连接没起作用，只要在连接板上有更多的菌落就行。挑选用于进一步筛选的菌落的个数，由对照板（在反应物中有连接酶）的菌落数与连接板上菌落数的比率决定。

例如，如果连接板上的菌落数比对照板多10倍，那么理论上（如果您正在进行标准的粘性末端定向克隆）您所挑选的10个菌落中有9个会将正确的片段连接到其中（由于多聚体或多联体等，这通常不会成为现实）。在这种情况下，挑选5-10个菌落应该绰绰有余。

如果与对照板相比，在连接板上只有两倍多的菌落，则最好挑选10个或更多菌落。可以将板放入冰箱中，如果需要可以挑选更多的菌落。在挑选菌落时不要过于冲动，挑选50只是浪费时间，除非您正在做一个非常困难的连接。

如果板之间没有差异，则说明反应失败。在这种情况下，不必再麻烦挑选菌落了。重复前面的步骤，尝试通过消化更长时间、去磷酸化更长时间、暴露于更少的紫外线、或尝试其他酶来减少背景。酶干脆无效是常事。

挑选菌落实验方案

1. 将板从37 ºC培养箱中取出后，将它们倒扣（即它们在培养箱中的放置方向）在工作台面上。
2. 使用移液器或类似仪器，将含有正确浓度抗生素的3-5 mL LB培养基（货号L3522、L2542或L3022）移液到无菌25 mL或50 mL试管中（试管数量取决于您想要培养的数量）或类似的带螺旋盖的管，并给它们贴上标签。细菌培养物与管中空气量的体积-体积比，对于确保细菌生长至足够密度是很重要的，类似说明书从来不会要求液体与空气之比低于1:3，但最好更高些。
3. 一只手拿着无菌移液器吸头靠近移液器的一端，另一只手拿起倒扣着的含有连接步骤生成的细菌的板。用手将板翻过来让细菌面朝上朝向您，然后用移液器吸头尖轻轻接触完全与任何其他菌落分离的菌落。
4. 现在将粘有细菌的同一个吸头放入含有LB培养基的试管（来自步骤2）中的一个中，并稍微移动一下吸头，以使一些细菌释放到液体中。有些人只是将移液器吸头弹射到培养基中，但如果这样做，第二天需要把它拿出来。
5. 在摇床中，37 ℃、190-225 rpm孵育这些试管过夜。

注意：上述程序应使用无菌技术进行。理想情况下，靠近本生灯进行，如果没有，1级罩就足够了。实际上，与其担心外部细菌污染样品（因为它们的污染机会很少，除非它们来自您之前在工作台上进行的其他实验），可能更值得注意的是每个样品间不要有交叉污染，因为您在同一种抗生素中培养所有这些样品。

冷冻细菌菌落

作为液体培养物生长的细菌菌落可以在4 °C下保存几周而不会变质。 任何已确认包含您的插入物的克隆，都应存储起来供长期使用。 最常用的克隆储存方法是冷冻甘油原液。对于室温下的替代品（特别适用于较大的样品数量），请考虑Biomatrica的CloneStable产品（货号93121-017）所使用的新技术。

甘油原液实验方案

1. 将5 mL甘油（货号G5516）与5 mL蒸馏无菌水混合，制备50％甘油原液。 充分混合。
2. 对于每个要存储的菌落，将500 μL过夜培养物与500 μL 50％甘油溶液混合。 充分混合，并分装到2 mL冷冻管中。
3. 储存在-80 °C。