使用SYBR Green染料检测的逆转录实验方案

逆转录

逆转录(RT)是指使用逆转录酶和dNTP将RNA转化为cDNA的过程。该过程既可对总RNA进行RT步骤，从而产生代表样品中所有RNA转录本的整体cDNA（通常通过两步法），也可通过基因特异性方法，仅将目标RNA转化为cDNA（通常遵循一步法）。

下述实验可用作RT基础实验方案，供研究人员对其进行修改以满足特定要求。通常使用两步法制备cDNA，随后在加入PCR / qPCR体系之前对cDNA进行稀释，或者通过一步法反应进行制备，依次进行两个过程。

设备

• 定量PCR仪器
• 用于RT-qPCR设置的层流罩（可选）

试剂

• RNA（约1μg/μL储存液）
• SYBR Green 定量RT-PCR试剂盒（货号QR0100）
• PCR级水：PCR级水（货号W1754或W4502），20mL等分试样；冻存；每次反应均使用新鲜的等分试样。
• 正向和反向PCR引物（10μM工作原液）：
  • 可在这里订购定制的寡核苷酸。 
    

耗材

• 无菌过滤器移液管吸头
• 无菌1.5 mL螺纹盖微量离心管（货号CLS430909）
  
  • PCR管和PCR板，选择一种以匹配所需格式：
  • 单个薄壁200 μL PCR管（货号Z374873或P3114）
  • 孔板
      - 96孔板（货号Z374903）
      - 384孔板（货号Z374911）
    
  • 封板膜
      - ThermalSeal RTS™封膜（货号Z734438）
      - ThermalSeal RT2RR™膜（货号Z722553）

方法

在下面给出的实验案例中，研究人员可以根据优化实验的结果对引物浓度进行调节（参见引物浓度优化、温度梯度法引物优化和检测方法优化和验证章节）。

1. 将试剂盒组分和RNA样品置于冰上。
2. 混合然后短暂离心以收集管底部的内容物。
3. 为每个反应和对照准备一份预混液，并根据表P11-28，额外添加10％的RT酶以允许移液误差
   。
4. 为每个对照组准备一个预混液，并根据
   表P11-28，额外添加10％的PCR级水（而非RT酶）代替酶以允许移液误差。

5. 向每个PCR管中加入1μL总RNA（每次反应250-2500ng）。如果使用PCR板，请按照板示意图进行操作，以确保将反应混合物、样品和对照物加入到正确的孔中。
   
6. 向每个孔中加入24μL 预混液，将无RT混合物添加至负RT对照样品中。
   
7. 密封每个反应或孔板后，轻轻涡旋以混合内容物。
   
8. 短暂离心以收集反应管底部的组分。
   
9. 根据表P11-29设置实时qPCR。

10. 进行反应后熔融分析。