术语“限制酶”源自Werner Arber和Matthew Meselson实验室对肠杆菌噬菌体λ(λ噬菌体)的研究。他们研究了某些大肠杆菌菌株通过酶促切割噬菌体DNA来抑制λ噬菌体活性的能力,而负责这种生长限制的酶就被称为限制酶。1, 2, 3
Werner Arber、Daniel Nathans和Hamilton O. Smith因其发现和表征了限制酶而于1978年获得了诺贝尔生理学或医学奖,自此开始了重组DNA技术的发展。
限制酶也称为“分子剪”,因为它们在称为限制性位点的特定识别序列处或附近切割DNA。这些酶在两条DNA链的每一条上形成一个切口,因此亦被称为限制性内切核酸酶。4
病毒通过将DNA注入细胞来感染宿主细胞。这种病毒DNA劫持宿主细胞的病毒后代繁殖机制,导致宿主细胞死亡。为了克服病毒感染,许多细菌和古细菌已经进化出几种机制。主要的保护机制涉及使用限制酶通过在特定限制性位点切割来降解入侵的病毒DNA。与此同时,宿主细胞通过使用称为甲基化酶的其他酶来保护其自身的DNA不被切割,这种酶使得宿主识别序列内的腺嘌呤或胞嘧啶碱基甲基化。对于每种限制酶,宿主细胞产生相应的甲基化酶,其甲基化宿主DNA,并保护宿主DNA不被降解。这些酶构成限制-修饰(R-M)系统。
限制酶催化DNA的磷酸二酯骨架中3'-氧原子与磷原子之间的键的水解。酶需要Mg2+或其他二价离子保持其活性。
Smith和Nathans在1973年对限制性内切酶的命名规则进行了建议。根据这些原则,酶的名称以斜体三字母缩写词开头。第一个字母表示分离出酶的细菌属的第一个字母,第二和第三个字母则来自细菌种群。后面还可以跟随其他字母或数字来表示血清型或菌株。然后是一个空格和一个罗马数字,表示识别顺序。例如,Hind III表示是从流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)血清型d分离出的四种酶中的第三种。6
基于组分、切割位点的特征、以及辅因子要求,限制性内切核酸酶分为四类:I 型、II 型、III 型和 IV 型。
切割位点在表中以红色箭头进行表示。
取决于底物DNA和反应条件,限制酶显示出广泛的切割差异和可能的星号活性。为了获得所需的切割,对以下因素的控制变得非常重要:
同裂酶是具有相同识别序列和切割位点的限制酶。举例:Sph I (CGTAC/G)和Bbu I (CGTAC/G)
异裂酶是具有相同识别序列、但在该序列内部的不同位点切割DNA的限制酶。举例:Tai I (ACGT/)和Mae II (A/CGT)
限制性消化双链DNA产生两种末端:粘性末端和平末端。
平末端具有促进连接的5'-磷酸基团。它们与其他平端DNA普遍相容。
由EcoR V产生的平末端
粘性末端是单链DNA短小链段,能够自我连接或与来自另一个DNA分子的互补区域连接。粘性末端具有含1-4个核苷酸的3'-或5'-悬突。
由Bln I(货号11558170001)产生的5’粘性末端
由Kpn I产生的3’粘性末端
我们的限制酶系列产品已经用五种独特的缓冲液进行了消化优化。当使用单一酶消化DNA时,请使用与酶一起提供的缓冲液。对于DNA的双重消化,则使用其中的两种酶均显示100%活性的缓冲液。或者,从常用双消化图表中确定最佳缓冲液。在某些情况下,由于缓冲液不相容(成分或温度),建议进行连续消化。关于用单一酶、两种限制酶以及连续DNA消化进行限制性消化的实验方案,请参见限制酶消化实验方案。选择正确的缓冲液对于获得两种酶的高活性和避免星号活性至关重要。我们提供五种缓冲液供用户选择相容的缓冲液进行所需的消化。大多数消化需要1-2种缓冲液,因此经济有效。
限制性内切核酸酶在特定识别位点切割DNA的能力,使得这些酶具有广泛的应用,成为许多分子生物学技术的必要工具。下面是一些主要应用:
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