类器官(organoid)是复杂的自组织三维细胞培养模型,通常由干细胞发育而来。1目前构建的类器官取材于各种组织,包括脑、2肠、3胃、4结肠、5肝、6胰、6肺、7肾8和患者来源肿瘤。9肠上皮类器官,通常称为类肠(enteroid)或迷你肠(mini-gut),保留胃肠道系统的生理特性,作为有效的细胞培养工具已用于建模研究肠道发育和肠道疾病,包括结肠癌、乳糜泻病、炎症性肠病和宿主-微生物组相互作用。10Clevers等开发的传统分离培养技术1需要进行长时间的肠道原代组织分离培养,且取材于小鼠或难于获取的人类组织样本。而诱导多能干细胞(iPSC)来源的类器官可通过来源更广阔的人类供体快速构建患者特异性细胞模型。我们现建立了人iPSC来源结肠类器官体系,提供已检测的高度表征的冻存人结肠类器官和扩增培养基。另提供优化的无血清培养基和试剂,可通过简单的三阶段分化流程将任意的人iPS细胞系分化为结肠类器官。
注意:起始材料采用高质量的未分化人ES/iPS细胞(SCC271),融合度约70-80%,分化细胞比<5%。下列方案用于组织培养处理过的6孔培养板的1个孔分化。方案体积为单孔用量,请根据需要调整体积。
图 2.人iPS细胞的内胚层分化。对人iPSC来源定型内胚层细胞进行内胚层标志物的流式细胞分析,表明经过4天分化的细胞呈CXCR4+、c-Kit+、Sox-17+、PDGFR-和FOXA2+表型。
图 3.定型内胚层细胞分化为后肠内胚层细胞。后肠内胚层诱导后第2天(A),第3天(B)和第4天(C)的后肠内胚层细胞形态。
结肠类器官的扩增
图 4.人结肠类器官。A)解冻后2天,结肠类器官包埋在Matrigel®基质胶dome中。B)培养第10-12天,结肠类器官占据dome的85-90%,可以传代。
人结肠类器官可使用3dGRO™类器官冻存液(SCM301)冻存。该冻存方案在人结肠类器官冻存传代过程中不使用任何解离试剂。建议每管冻存4个dome,每个dome密度为90%。如密度低于90%,每管冻存更多dome。
图 5.人iPS细胞来源结肠类器官的形态。成熟的人结肠类器官三维培养后呈现复杂形态。A) 4倍放大 B) 10倍放大。
人结肠类器官特性 |
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CDX2
CA-IV/DAPI
黏蛋白-5B/DAPI
黏蛋白-2/F-肌动蛋白/DAPI
CDX2
CA-II/DAPI
CA-IV/DAPI
黏蛋白-5B/DAPI
黏蛋白-2/F-肌动蛋白/DAPI
E-Cad/DAPI
图 6.人结肠类器官的免疫细胞化学分析(ICC)特性。人iPS细胞来源结肠类器官呈CDX2、α-碳酸酐酶II、α-碳酸酐酶IV、黏蛋白-5B、黏蛋白-2和E-钙粘蛋白阳性。
图 7.人结肠类器官的免疫组化分析(ICC)特性。A)阿尔新蓝染色鉴定杯状细胞 B)Ki67抗体(红色)鉴定增殖细胞 C)H&E染色鉴定细胞核与细胞质蛋白。
我们建立了可靠的三阶段分化培养方案,成功通过人多能诱导干细胞(iPSC)制造人结肠类器官。获得的结肠类器官表达成熟的结肠标志物CDX2、α-碳酸酐酶II、α-碳酸酐酶IV、黏蛋白5B、黏蛋白2和E-钙粘蛋白,并可连续传代多次而不丧失结肠表型。我们的类器官和无血清培养基组合可提供充分验证的三维细胞新模型,用于药物发现的肠道疾病研究。
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