本实验方案用于将NHS-酯修饰,例如TxRd(磺酰罗丹明101-X)(方案对大多数NHS-酯修饰有效),缀合到含有氨基标记(例如5'-氨基-修饰物C6)的寡核苷酸上(图1)。由于TxRd(磺酰罗丹明101-X)和几种其他修饰仅以NHS酯的形式提供,因此它们必须在单独的合成后反应中手动缀合至氨基标记的寡核苷酸。
缀合过程分为两个主要步骤:1)缀合反应,和2)通过缀合后沉淀去除过量的游离NHS-酯修饰。
尽管HPLC是除去过量的游离NHS-酯修饰和未偶联的寡核苷酸的常规方法,但是其他纯化方法(例如沉淀法)也可能有效。沉淀(见下文)能除去大部分但不是全部剩余的NHS-酯修饰。取决于应用,未缀合的修饰可以是个问题。虽然因为NHS-酯已被缓冲液水解所以它不会进一步反应,但它可能导致背景噪音,从而导致不良的信噪比(如果修饰是染料,例如TxRd(磺酰罗丹明101-X)),或者导致表面负荷密度降低(如果修饰是用来附着的,例如生物素)。此外,未偶联的寡核苷酸也会留下来。
从建议的条件开始,视需要进行优化。
缀合后沉淀在2 mL管(更大的反应规模则用50 mL管)中进行。务必保护好染料免被曝光。
现在寡核苷酸已经与修饰物缀合,当在应用中需要用时,可将其溶解在水或缓冲液中。
制备50 mL 0.091 M NaB缓冲液
其他非胺缓冲液可以代替NaB,只要pH不高于8.5(更高的pH将太快地水解NHS-酯)。
制备NHS-酯修饰
NHS-酯修饰是以无水试剂形式供应的,装在气密瓶子里。在加入氨基标记的寡核苷酸缓冲溶液之前,切勿使NHS-酯受潮,否则它们会快速水解。使用无水DMSO或其他溶剂。
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