本实验方案用于两条序列互补的单链寡核苷酸的退火反应(图1)。加热后冷却有助于杂交反应的进行。
图 1.退火反应示例图。加热“打破”了所有的氢键,从而破坏了每个寡核苷酸内的全部二级结构。随后,缓慢的冷却促进了杂交反应,最终在互补的序列间形成新的氢键。
该退火反应分为两个主要的步骤:1)溶解,2)使用恒温槽或者热循环仪退火。
尽管每种寡核苷酸都是已知量的,我们仍然建议使用分光光度计进行验证, 这可以保证加入反应的每种寡核苷酸是等量的。
示例
双链寡核苷酸目标浓度为50 µM。
*以上为配制100 µM溶液的简单计算方法,仅作为示例。如需了解更多关于不同寡核苷酸浓度的计算,请参阅“处理指南和稳定性”。
恒温槽
热循环仪
相对于恒温槽,热循环仪的稳定性更好。
在恒温槽或者热循环仪操作后,得到的双链寡核苷酸可以用于后续操作或者用于保存。更多关于保存核苷酸的信息,请参阅“处理指南和稳定性”。
所有缓冲液均采用Milli-Q®纯水配制。
此缓冲液通常用于T4 DNA连接酶。
此缓冲液通常用于T4多核苷酸激酶。
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