REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒实验方案

货号XNATS, XNAT, XNATR

概览

REDExtract-N-Amp™组织PCR试剂盒包含从小鼠尾巴和其他动物组织、口腔拭子、毛干和唾液中快速提取和扩增基因组DNA所需的所有试剂。简而言之，在室温下将样品与提取溶液和组织制备溶液的混合物孵育10分钟，原料即可释放DNA。不需要机械破碎、有机提取、柱纯化或DNA沉淀。  

加入中和溶液B后，提取物可用于PCR。然后将等分的中和后的提取物与REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物和用户提供的PCR引物组合，即可扩增靶DNA。REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物是含有缓冲液、盐、dNTP和Taq聚合酶的2X反应混合物。其专门针对反应试剂进行了优化。它还含有JumpStart™ Taq抗体（用于热启动PCR以增强特异性），以及REDTaq^® 染料（以将PCR产物直接加载到琼脂糖凝胶上）。

需要但未提供的试剂和仪器：

• 微量离心管（1.5或2 mL）或多孔板用于提取（200 μL最小孔容积）
• 剪刀，微型切割，货号Z265985
• 镊子（中小款）
• 口腔拭子（无菌泡沫尖涂抹器，货号A9601）
• 样品采集卡 — 血迹卡，货号C2613
• 用于PCR的管或板
• 95°C加热块或热循环仪
• PCR引物
• 热循环仪
• 水，PCR试剂，货号W1754
  

操作流程

除非另有说明，否则所有步骤均在室温下进行。

A. 从小鼠尾巴、动物组织、毛发或唾液中提取DNA

1. 移取100 μL提取溶液到微量离心管或多孔板的孔中。向管或孔中加入25 μL组织制备溶液，上下移液混合。
   
   注意：如果要进行多次提取，可以在使用前最多2小时以4:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。
    
2. 对于新鲜或冷冻的小鼠尾巴：在使用前及处理不同样品的间隙，采用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。将0.5-1 cm的小鼠尾尖（切割端向下）放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保小鼠尾巴浸没在溶液中。
   
   注意：对于新鲜小鼠尾巴，请在剪断尾巴后30分钟内进行提取。
   
   对于动物组织：在使用之前及处理不同样品的间隙，采用70％乙醇冲洗剪刀或手术刀和镊子。将2-10 mg组织块放入溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。确保组织浸没在溶液中。
   
   对于发干：在使用前及处理不同样品的间隙，采用70%乙醇冲洗剪刀和镊子。剪去多余的发干，保留发根，将样品（根端向下）放入溶液中。每次提取只需要一根带根的发干。
   
   对于唾液：移取10 μL唾液到溶液中。通过涡旋或移液彻底混合。
   
   对于在卡片上干燥的唾液：将50 μL唾液吸移到收集卡上，并使卡片干燥。使用前和不同样品之间用70％乙醇冲洗打孔器。在卡上有干燥唾液样品的区域用打孔机冲下一片圆片（最好是1/8英寸或3 mm）。将圆片放入溶液中。在硬表面上轻敲管或板，以确保圆片在培养期间浸于溶液中。
    
   
3. 在室温下孵育样品10分钟。 
   
4. 将样品在95°C孵育3分钟。
   注意：孵育结束时组织不会被完全消化。这是正常现象，不会影响性能。
    
   
5. 向样品中加入100 μL中和溶液B，并涡旋混合。 
   
6. 将中和的组织提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。
   注意：长期储存时，取出未消化的组织，或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月，在大多数情况下没有明显的损失。
   

注意：第C部分第1步 — 长期储存时，取出未消化的组织，或将提取物转移到新的试管或孔中。提取物现在可以在4°C下储存至少6个月，在大多数情况下没有明显的损失。

B. 口腔拭子的DNA提取

1. 收集拭子上口腔细胞，让拭子干燥。干燥时间约为10至15分钟。
   注意：由于用于DNA提取的溶液体积较小，应使用泡沫尖端拭子。应避免使用纤维尖端的拭子，如棉花或涤纶拭子，因为溶液无法有效回收。 
   
2. 移取200 μL提取溶液到1.5 mL微量离心管中。向管加入25 μL组织制备溶液，上下移液混合。
   注意：如果要进行多次提取，可以在使用前最多2小时以8:1的比例预先混合足量的提取和组织制备溶液。 
   
3. 将干燥的口腔拭子放入溶液中并在室温下孵育1分钟。 
   
4. 在溶液中转动拭子10次，然后将拭子转动着在管壁上抿，以从拭子中将多余的溶液挤出。丢弃拭子。盖上管盖并短暂离心。 
   
5. 在室温下孵育样品10分钟。 
   
6. 将样品在95°C孵育3分钟。 
   
7. 向样品中加入200 μL中和溶液B，并涡旋混合。 
   
8. 将中和的提取物储存在4°C或立即用于PCR。继续第C部分第1步。
   注意：提取物可在4 °C下储存至少6个月，在大多数情况下没有明显的损失。
   

C. PCR扩增

REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物含有JumpStart Taq抗体，用于特定的热启动扩增。因此，PCR反应可以在室温下进行而不会过早产生Taq DNA聚合酶活性。

典型的最终引物浓度约为0.4 μM。最佳引物浓度和循环参数取决于所使用的系统。

     1.将以下试剂加入到薄壁PCR微量离心管或板中：

注意：REDExtract-N-Amp™ PCR反应混合物配方用于补充提取、组织制备和中和溶液中的成分。如果将少于4 μL的组织提取物添加到PCR反应物中，则按50:50的提取物：中和溶液B混合比例，使组织提取物的体积达到4 μL。

     2.轻轻混合。
     3.对于没有加热盖的热循环仪，在每个管的混合物顶部添加20 μL矿物油以防止蒸发。                        进行热循环。扩增参数应
4. 针对各个引物、模板和热循环仪进行优化。

5.PCR结束后，将扩增的DNA加到琼脂糖凝胶上。不必加入单独的 上样缓冲液/示踪染料。
注意：如果需要，可以对PCR产物进行纯化，用于下游应用，例如使用GenElute^TM PCR清除试剂盒（货号NA1020）进行测序。

致购买者：有限许可证

本产品的使用受到如下一项或多项美国专利及其对应的境外专利声明保护：  5,789,224、5,618,711、6,127,155以及在美国境外对应于已过期的美国专利5,079,352的专利申请。基于仅将该数量的产品用于购买者自己内部研究的前述专利声明，购买该产品享有一项不受限、不可转移的诉讼豁免权。未通过明示、暗示或禁止反言形式授予购买者任何专利主张下的权利、执行任何专利方法的权利或开展任何形式的商业服务的权利，包括但不限于出于经济利益或其他商业考虑报告购买者的活动结果。本品仅供研究使用。如需用于Roche专利许可的诊断用途，需另外征得Roche许可。有关购买许可的更多信息，可联系Director of Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, USA获取。 

JumpStart和JumpStart抗体在美国获得许可。专利号5,338,671和5,587,287以及在其他国家的相应专利。

GenElute、JumpStart和REDExtract-N-Amp是Sigma-Aldrich Co. LLC.的商标。
REDTaq是Sigma-Aldrich Co. LLC.的注册商标。