PCR 实验优化和验证

优化PCR条件

即使使用经过预先设计和可商购获得的实验方案，方案的优化和验证也是必不可少的。为了确保实验方案具有所需的敏感性，并对目标靶标具有特异性，优化是必需的。例如，稀有mRNA的病原体检测或表达性能分析需要高灵敏度；SNP检测需要高特异性，病毒定量需要高特异性和高灵敏度。要求具有高特异性的实验方案在没有优化和适当对照的情况下进行时，特别易受影响。与此类似，当要在多重反应中同时检测多个靶标时，必须优化实验条件以平等地检测所有靶标。验证提供的数据可以证明在进一步的研究项目中能否继续使用某特定测定¹。

可通过调整许多因素实现理想的检测性能，从而实现更高的分子灵敏度、特异性和精确度。从经验丰富的商业供应商处购买的检测产品仍然需要在使用它们的实验室内进行验证。应在研究条件下验证与测定性能有关的声明，包括测试样品、特定试剂和选择的仪器。

已经设计好的并符合所有期望的设计标准（参见PCR / qPCR / dPCR实验设计）的实验方案可能在广泛的条件下表现良好。然而，所有实验方案都具有一组最佳条件，这些条件取决于仪器、所选试剂（缓冲液条件）、引物浓度和/或退火温度 (T_a)、镁浓度、甚至升降温速率。由于通常在选定的仪器上并在标准缓冲液条件下进行测定，因此大多数优化程序集中于使用引物浓度或退火温度(T_a)/解链温度(T_m)来修改引物结合动力学上。

无论靶标是DNA（qPCR）还是RNA（RT-qPCR），以下预备步骤都有助于确保成功量化：

• 验证引物设计
  
• 优化引物浓度
  
• 优化引物退火温度
• 优化探针浓度
  
• 优化反应组分和多重条件
  
• 使用标准曲线和解链曲线分析验证性能

验证引物设计

当采用先前出版物中的引物或使用商购获得的方案时，引物设计的验证尤其重要。可以根据PCR / qPCR / dPCR实验设计中提供的实验设计指导来审查引物设计。至关重要的是要确保：

• 引物与目标靶序列同源。
  
• 反向互补引物是正确的。仔细检查反向互补碱基顺序（用http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html）。
  
• 检测到适当的剪接变体。
  
• 除非实验需要，避免使用SNP。
  
• 寡核苷酸和扩增子不采用二级结构。
  
• 反应寡核苷酸相互杂交的可能性小。

引物二聚体

引物彼此杂交的能力，特别是在3'末端，可能导致PCR期间引物延伸和形成靶标非依赖性产物，称为引物二聚体。每当产生和扩增引物二聚体产物时，它们将反应组分从合成所需产物中转移出来，从而降低检测效率和灵敏度。因此，引物二聚体是使用基于探针和基于SYBR Green I染料的检测反应中存在的问题。对于基于染料的检测，例如SYBR Green I，引物二聚体还影响测定特异性，因为非特异性DNA结合染料将与引物结合，并与目标产物一起被检测出来。因此，应避免使用可能形成引物二聚体的引物。

引物二聚体形成可能性

为了确定引物二聚体形成的可能性，使用引物设计软件来分析双链体形成。  OligoArchitect（sigma.com/probedesignonline）提供了自身二聚体和交叉二聚体杂交强度的详细信息（图9.1）。由引物与其自身或与其配偶体杂交形成的任何3'-末端二聚体必须非常弱（ΔG ≥ -2.0 kcal，图9.1）。

如何减少引物二聚体形成？

应避免任何具有末端ΔG < -2.0 kcal、同时又具有可延伸的3'-末端（5'-重叠）的引物。最强的总二聚体应该是不稳定的（ΔG ≥ -6.0 kcal）。为了避免强的3'-末端二聚体，同时保持特异性，选择在最后5个碱基中具有2个G或C残基的引物，在最后3个碱基中具有1个G或C，在3'-末端具有A或T（图9.1）。

优化引物浓度和退火温度 (T_a)

当使用引物浓度优化实验条件时，选择固定的T_a（通常为60℃），并且对每种引物独立设置最佳条件。这在设计多重运行的测定时非常重要，因为所有反应必须在相同的退火温度下运行，并且这是一种策略，这种策略还可以用于挽救性能差、又没有替代设计可用的实验方案。技术上更简单的方法是选择固定的引物浓度，然后优化T_a ，对这些引物组合选择最佳结果。当使用多种测定和进行dsDNA结合染料检测时，例如SYBR^® Green I，这是首选方法。但是，这种方法确实需要一种能够利用不同T_a选择同时运行几个反应程序的仪器。

优化引物浓度

当使用基于探针的qPCR时，通常同时使用500 nM引物和250 nM探针的最终浓度获得令人满意的结果，尤其是在PCR靶标丰富且不需要最大灵敏度的情况下。当使用基于SYBR Green I染料的检测以最小化非特异性扩增时，以及在优化多重反应时，使用200 nM与400 nM之间浓度稍低的引物，通常更好。要验证标准条件是否适合使用，请进行标准曲线分析（参见测定的评估）。如果检测是线性、可再现的，并且在样品中预期的目标浓度范围内梯度处于-3.2至-3.5之间，则可能没有必要进一步优化引物和探针浓度。

实验方案没有很好地优化的一些迹象是：重复运行之间缺乏再现性，并且通常效率低且不敏感。检测的性能通常在一系列引物浓度下测试，例如50 - 800 nM，用每种浓度的每种引物（图9.2；关于完整的实验方案，参见附录A，实验方案：引物的优化）。

选择了产生最低C_q、最低重复变异和NTC阴性的浓度组合（见图9.3）²。

如果多重反应中的一个靶标明显比其他靶标更富集，或者如果一个引物对产生比其他靶标低得多的C_q，则该靶标的扩增可能会主导反应，在可检测到其他靶标之前，抢先用完反应组分。调节引物的浓度可以实现所有靶标的更均衡的扩增。为了确定这样的调节是否有益，准备标准曲线（参见测定的评估），其涵盖每个引物对单独（单重）和所有引物组合（多重）所预期的靶标范围。如果多重和单重反应得到相似的结果，则引物浓度是合适的。另一方面，如果多重反应中的灵敏度是不可接受的，优化引物浓度可能会改善结果。降低导致低C_q值的那些引物对的引物浓度，和/或增加产生高C_q值的那些引物浓度，但应保持在50 - 500 nM的范围内。

优化引物退火温度

定量PCR检测通常使用两步或三步温度循环程序进行，通常具有35-40个循环。两步反应在两个温度之间循环，通常为95℃（通常为10-15秒）和60℃（通常为30-60秒，或者在快速条件下为5-10秒）。当运行双标记探针（TaqMan或水解）检测时，选择两步温度反应，因为较低的温度与较长反应时间能促进DNA聚合酶的核酸外切酶活性，并阻止探针的置换。这会是在相同参数下进行许多不同检测的有利的循环条件方案。然而，使用两步法的缺点是它减少了可用的引物设计种数，且将实验方案的优化仅限于对引物浓度的优化，因为两步法不可能进行退火温度(T_a)的优化。

如果靶序列复杂，而且所选择的引物难以优化，或者所使用的检测系统不依赖于水解探针的使用，那么首选实验方案是三步循环。三步循环策略是在如下条件之间循环：95°C（通常为10秒），退火温度（介于55°C和65°C之间，通常为10-20秒，或者快速条件下为5秒）和72°C（通常为20-30秒，或在快速条件下为15-20秒）。在这种情况下，可以使用以下方案优化T_a以进一步提高检测性能：

• 从要测试的T_a范围的低端开始，这由引物的T_a确定，并以一定增量逐渐增加温度（通常在55°C和65°C之间测试）。有些仪器有梯度仪，只需运行一次即可完成温度优化。
  
• 通过PCR后解链曲线分析或琼脂糖凝胶电泳测试每种反应产物的特异性，如下所述。
  
• 最佳退火温度是产生最低C_q（即NTC阴性）时所在的温度，解链曲线分析表明了特异性产物的检测以及重复反应之间的再现性。

如果退火温度太低，则反应将是非特异性的。然而，如果温度太高，严苛性可能影响反应效率，导致缺乏扩增或非常高的C_q值、非常差的产率和低再现性。

温度优化的一个例子如图9.4所示。在这种情况下（图9.4A），在梯度PCR仪上进行相同的反应，使得退火温度在47.8℃和71.7℃之间。在64.8℃和61.7℃下退火产生了相同的C_q值，但稍低的那个温度的产物产率较高，因为较高的终点荧光和明显较高的反应效率（可从扩增曲线的梯度看出） 都证明了这点。如要绝对地确定反应效率，需要进行标准曲线评估（参见测定的评估），或者使用单管效率测定算法^3,4。图的第二部分（图9.4B）显示了在相同反应条件下但在不同试剂混合物中引物行为的比较。在这里可以明显看出，缓冲液组分影响测定的再现性以及数据保持稳定的温度范围。最后，针对相同的靶基因设计了两个独立的测定，它们都用每种缓冲液进行了优化。如图9.4C所示，每种缓冲液需要不同的最佳温度使两个引物对产生相当的C_q数据（在LuminoCt中为61.7℃，在KiCqStart中为58.4℃，两种都是Sigma试剂）。

尽管大多数商购实验方案都提供有标准PCR检测条件，但是个性化方案通过进一步优化，可以鉴定对特定引物组合特异的条件。这可能是由于引物二聚体、非特异性扩增、或在所选择的默认条件下的次优反应效率。完成优化后，应通过将所选条件应用于一系列标准品的测量并制备标准曲线来计算测定效率（参见测定的评估）。即使在优化之后，效率仍可能是次优的，在最坏情况下，可能需要进行新的测定。

在开始优化过程之前，用户应定义可接受的效率值范围。理想情况下，效率应 > 95％。然而，效率 < 90％的检测方案也有可能进行精确测量，并且如同引物设计一样，靶序列不能以更高的效率扩增。尽管如此，当使用效率较低的检测方案时，可能会影响检测的精确度和极限。在这种情况下，在解读和报告数据时必须酌情考虑¹。

优化探针浓度

最终浓度为250 nM的探针可用于大多数检测方案。然而，如果不需要最大灵敏度，则较低浓度的探针可能就足够了，这样可以降低测定成本。为了优化探针条件，在最终浓度范围50至500 nM内的几种浓度下测试探针，结合优化的引物浓度和预期包含在最终实验中的靶核酸的最低浓度。可以使用允许进行最灵敏检测的最低探针浓度（C_q ≤ 30，具有最佳再现性）。

优化反应组分和多重检测体系

有些检测对缓冲液 / 反应条件特别敏感。对于这些检测，通过优化MgCl₂浓度进一步修饰反应缓冲液，添加PCR增强剂（Mueller in PCR Technologies; Current Innovations, 2013⁵），或者调节仪器升温速率，都可以改善测定性能。除了前文所述的实验方案优化指南外，这些因素在优化多重反应时尤为重要。

优化 Mg²⁺浓度

镁在PCR中起着多种作用。它是dNTP所需的二价阳离子抗衡离子，是所有聚合酶的辅助因子。二价阳离子强烈影响DNA双链杂交。增加镁浓度可提高DNA双链体的稳定性或解链温度。由此可见，高镁含量增加了引物对杂交的亲和力，包括错误引发事件和引物-引物相互作用。错误引发的DNA双链体成为DNA聚合酶的底物，实际上产生副产物和降低PCR效率。因此，MgCl₂的浓度对PCR的特异性和产率都有影响，因为镁影响引物与靶标的杂交、Taq DNA聚合酶的持续合成能力、以及外切核酸酶基团在用于qPCR探针切割时的水解速率。因此，如果MgCl₂不足，由于DNA聚合酶的聚合速率低，引物结合受损，且探针切割效率低，而会导致产率低。但如果MgCl₂的浓度太高，则反应的特异性将受到损害，因为这将造成非特异性引物杂交的稳定性提高。

与使用1.5-2 mM标准MgCl₂浓度的常规PCR测定相比，水解探针qPCR测定需要更高浓度，约3-5 mM，以实现探针的有效切割。MgCl₂的存在还增加DNA杂交的速率，使得在许多仪器使用的快速循环条件下能有效杂交。当进行多重反应时，MgCl₂浓度的优化变得更加重要。

KCl或(NH₄)₂SO_4,等盐亦改变DNA双链体T_m，但是这些单价阳离子的影响不那么强。

当执行多重PCR时，图9.5中所示的影响加重。同时进行多个反应会引入试剂竞争，并使次优条件变得更加不良，从而造成PCR效率的重大变化。

变温速率

很少会有困难的反应需要进一步修改的情况。当所有其他选择都已用尽时，可以通过经验性测试和修改PCR变温速率来解决问题。

探针荧光基团和淬灭基团选择

在运行多重测定时，也很重要的一点是应最大限度地加大不同荧光团多个发射的光谱分离度，以方便信号分离和数据分析。因此，具有较窄但分辨率良好且分得宽的带宽的荧光团，可用于多重应用。然而，实际上荧光团的选择受仪器光学系统的限制。  定量PCR和数字PCR检测方法包含有关荧光团和猝灭剂选择的进一步信息。

定量逆转录PCR (RT-qPCR)优化指南

在执行RT-qPCR时，不仅要考虑前面讨论过的标准qPCR的指南，并按照逆转录中的讨论优化RT，还要注意以下RT步骤中特有的一些重点：

• 验证RNA质量（参见样品纯化和质量评估）
  
• 确认引物跨度或侧翼长内含子（参见PCR / qPCR / dPCR实验方案设计）
  
• 优化逆转录（参见逆转录）
  
• 验证无逆转录酶（无RT）对照数据。

确认引物跨度或侧翼长内含子

虽然大多数gDNA在RNA纯化过程中已从样品中去除，但没有任何步骤可以去除所有DNA。由于PCR能够扩增单个DNA分子，因此当使用RT-qPCR时，污染DNA也和RNA一起被扩增。如果靶mRNA相当丰富（每个细胞数百或数千个拷贝），则与来自RNA的产物相比，来自DNA污染扩增的结果信号可以忽略不计；然而，如果靶mRNA是中等丰度或稀有（每个细胞<100拷贝），则DNA扩增产生的信号可能导致错误地高估mRNA水平。为了避免在RT-qPCR期间DNA扩增，尽可能使用侧翼内含子不存在于mRNA序列中、或者侧翼内含子跨越外显子-外显子连接的的引物（参见PCR / qPCR / dPCR测定设计）。

如果感兴趣的基因不含内含子，如果内含子位置未知，或者没有合适的引物跨越或侧翼内含子，则可能需要用不含RNase的或扩增级的DNase I 来消化输入的RNA。来自无RT对照的数据可用于确定是否需要用DNase I 进一步消化。

验证无逆转录酶（无RT）对照数据

无论引物是跨内含子还是侧翼内含子，RT-qPCR测定的特异性都应该在不含逆转录酶（无RT对照）的对照反应中进行测试，以评估污染DNA的潜在扩增。如PCR / qPCR / dPCR实验方案设计所述，具有短内含子（≤ 1kb）的DNA序列可以在RT-PCR中成功扩增。许多基因具有缺少一个或多个内含子的额外拷贝或假基因。因此，应通过进行含有RNA样品但不含RT酶的反应以及含有RNA和RT酶的反应来测试DNA对RT-PCR测定结果数据的影响（图9.6）。如果无RT反应的C_q值比RT6反应的Cq值高至少5个循环，则认为DNA扩增在qPCR中是可接受的。然而，如果有和没有RT的反应的C_q值相差少于5个循环，则DNA扩增可能影响了mRNA定量。

当RNA的DNA污染对实验信号影响很大时，应在RT-qPCR之前用不含RNase的、或者用扩增级的DNase I消化RNA，以实现可靠的mRNA定量。注意，柱上DNase消化（这是与许多可商购获得的RNA纯化试剂盒一起提供的程序，在这种程序中，在RNA与二氧化硅柱结合时进行DNase消化）在消除DNA方面不如从柱上洗脱RNA后在溶液中消化有效。因此，柱上（OC）DNase消化可能不足以进行RT-qPCR（图9.7）。应使用DNase消化的RNA进行无RT对照，以验证消化是否成功且充分。在图9.7所示的例子中，OC DNase消化足以可靠地检测靶mRNA。如果需要更高的灵敏度，那么要想可靠地量化不太丰富的mRNA，柱上消化是不够的。

注意，不同类型的细胞和组织以及不同的生长条件，会产生浓度显著不同的特异性mRNA。此外，不同的RNA纯化方法产生不同量的污染DNA。因此，应该使用每种新的起始材料、RNA制备方法或测定至少进行一次有和没有逆转录的反应。

测定方案评估

优化了实验方案并确定了最敏感的条件之后，应确定实验方案的特异性、效率和技术动态范围。

使用解链曲线分析确定特异性

可使用解链曲线分析来确定特异性。要进行解链曲线，需要掺入报告染料，如SYBR Green I染料，或使用非水解探针，如Molecular Beacon或Scorpions^®探针（参见定量PCR和数字PCR检测方法）。在qPCR期间产生扩增子后，将其在逐渐升高的温度下孵育，通常在55℃至95℃之间。然而，用户应验证其扩增子的理论解链温度落在该范围内，因为这将取决于大小和GC含量。实验T_m随反应运行的不同而略有不同，主要是由于MgCl₂和其他离子浓度的差异。

确定荧光的变化并绘制荧光随温度变化的曲线。由于SYBR Green I 是一种与任何双链DNA结合的非特异性染料，因此在使用这种检测化学品时，验证qPCR是否仅产生所需产物非常重要。解链或解离曲线分析可用于确定产物的数量和大致的大小。高特异性测定在仅含有靶标的反应中在高温下产生单个解链峰，在无模板对照中没检测到，或者只检测到非常少（图9.8A）。如果解链曲线具有多于一个主峰，如图9.8B和9.8C所示，则可以通过将产物溶解在溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上，来进一步研究产物的特性。如图9.8D和9.8E所示，反应B和C含有过量的引物二聚体或其他非特异性产物。降低引物浓度通常会减少非特异性产物的量。如果降低引物量后仍然测到大量非特异性产物，则最好重新设计引物。

图9.9给出了一个示例，显示了RNA的gDNA和NTC引物二聚体污染的解链曲线分析。在图9.9A中，特异性产物在测试反应中明显，而NTC中则有一种解链温度较低的数量较少的产物。这表明在没有模板的情况下有引物二聚体形成。这是常见的，只有当这些引物二聚体产物在测试样品中很明显时才会引起关注，如图9.8所示。图9.9B中的示例显示，使用相同的测定（在这种情况下，引物位于跨越内含子的外显子中）检测DNA样品中未经处理的gDNA基因，所述测定也用于mRNA检测。解链曲线显示了产物的独特性，gDNA产物在较高温度下解链，因为它还含有一个内含子。

在设计基因分型测定时，特异性至关重要。这些通常是探针测定，并且需要能够区分单个碱基差异，例如区分单个单核苷酸多态性（SNP）。在这种情况下，必须对照已知含有特异性匹配序列和不匹配序列的模板，在单个反应中测试每个探针。

效率及检测局限测定

衡量测定性能的一个最有效方法，是由连续稀释的模板构建一个标准曲线。测定方案效率即是标准曲线梯度的一个因子。以各种样品浓度运行，确保它们均达到极限稀释度，从而在同一实验中确定测定的技术动态范围。

任何合适的模板材料都适合于测定性能的这些技术测量。选择标准的可转移基准材料可以进行实验室间和实验室内的验证。因此，这一验证阶段可以在线性化的或带切口的质粒上进行（超螺旋DNA不能有效扩增并导致低再现性），亦可在克隆片段或合成寡核苷酸上进行。然而，必须认识到，对这些靶标的验证是对测定功能的衡量，不能适应由生物样品的复杂性引入的可变性。

从标准曲线确定技术动态范围和测定效率如图9.10所示。在这个例子中，模板经过11对数的10倍连续稀释，因此理论检测极限为3个拷贝（最低_Cq），但该测量的精确度明显取决于再现性，在这么多循环中，再现性相对较低。

通过测量标准曲线的梯度来确定测定效率，标准曲线描述了目标浓度的对数与C_q的关系图（图9.10）。测定效率为100％表明每个循环的倍增发生在E=2和-3.323的梯度时。

     效率可以根据下列等式计算：

     效率 = 10^{(–1/斜率)} –1。注：许多仪器的软件以百分比表示效率。该值是
；E=2的百分比因此，95％的效率等于E=1.9。

     斜率 = m，在标准曲线上由等式 y = mx + C确定。

     C是y轴上的理论截距，提供了测定灵敏度的相对测量值。

-3.1至-3.6之间的斜率对应90％至110％的效率，这是通常可以接受的范围，但重要的是，只要测定允许，应尽量接近100％。图9.11中显示的数据给出了一系列不同测定的效率和灵敏度的正常变化范围。这表明了在出版物中报告这些数据的重要性^1,6-8。

目前有人提出了取代标准曲线效率计算的方法。这些方法报告了在试管中进行单次反应所测得的效率。这些方法用算法模拟扩增曲线，因此取决于荧光增加的循环数。当使用DNA结合染料或Scorpions^® 探针进行测量时，这些方法最有可能成功，因为这些测定在每个循环都可产生较大的荧光变化。虽然这种方法可能成为取代标准曲线的理想替代方法，但后者仍然是用于测定评估的更常用方法。这是因为使用标准曲线不仅可以估算效率，还可以提供关于工作动态范围、灵敏度和可再现性的信息，并且在概念上更容易使用⁹。

R²值，也就是数据在标准曲线直线部分的拟合程度，是衡量再现性的一个参数，受移液准确度和测定动态范围的影响。因此，在对测定进行评估时，必须对每个稀释度至少进行3次技术重复。如果R² ≤0.985，则该测定可能不能给出可靠的结果，因为每次重复之间的再现性太差。如果输入核酸的最低水平处有一个或多个点偏离图中的线性区域，则说明测量的浓度可能超出了测定灵敏度。如果输入核酸的最高拷贝数处有一个或多个点偏离图中的线性区域，则说明反应可能饱和，并且靶标浓度超出有用的测定范围。或者，如果有几个随机点在线的上方或下方，则说明移液准确度或测定优化可能有问题。确认吸头与移液器正确匹配，并且分液体积可再现，并按上文验证引物优化。

标准曲线是验证多重反应的重要工具。同时进行多个反应会引入试剂竞争，并使次优条件变得更加不良，从而造成PCR效率的重大变化。图9.12证明了这一点。分别进行两个引物 / 探针靶标的效率曲线反应，然后进行多重反应。该图表明，虽然各个反应（深蓝色和绿色线条）给出相对相似的效率和灵敏度（y轴值），但一起运行反应时会显著改变多重反应的灵敏度和效率。