捕获ELISA
捕获ELISA(也称为“三明治”ELISA)是一种灵敏的方法,可用来定量许多皮克到微克级别的物质(如激素,细胞信号化学物质,传染病抗原和细胞因子)。几个原因使得需要这种类型的ELISA而不是直接或间接ELISA:待分析的物质可能太稀而不能与聚苯乙烯微量滴定板结合(如细胞培养上清中的蛋白质),或与塑料结合不佳(如小的有机分子),可能混合了太多的其他物质以至于不能很好的与平板结合。描述及利用捕获ELISA的两个Sigma试剂盒是TNF-α试剂盒和小鼠分型试剂试剂盒(货号ISO2)。
试剂和设备
- 磷酸盐缓冲盐(PBS):10mM磷酸盐缓冲液,pH 7.4,150mM NaCl片剂(货号P4417)和0.1%叠氮化钠(货号S2002)
- 碳酸盐-碳酸氢盐缓冲胶囊,pH9.6(货号C3041)
- 洗涤液(PBS-T):10mM磷酸盐缓冲液pH7.4,150mM NaCl,0.05%Tween 20(货号P3563)
- 捕获或包被抗体
- 用于标准曲线的对照抗原
- 标记的检测抗体
- 底物。通常使用最敏感的底物(例如使用过氧化物酶作为酶标记时,则为TMB或OPD)。
- 终止液(可选)
- 微量滴定板
- 酶标仪
操作流程
注意:提供的步骤为通用的方法。捕获抗体、样品、对照和检测抗体的最佳稀释度以及孵育时间需要凭经验确定,可能需要大量的滴定实验。理想情况下,可以使用本方案中所描述的酶标记的检测抗体。但是,如果检测抗体未标记,则二抗不能与包被抗体或样本发生交叉反应。也应包括合适的阴性和阳性对照。
捕获抗体的包被
- 在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液或PBS中适当稀释捕获或包被抗体。捕获抗体通常以0.2至10μg/ ml铺板。 优先选用使用亲和纯化的抗体或至少IgG部分使用亲和纯化。
- 按每孔0.2ml将稀释的捕获抗体加入到微量滴定板的每个孔中。
- 37°C孵育1小时(需完全覆盖)。
- 去除包被液,用洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤平板3次。
对照和样品的结合
- 将0.2ml适当稀释的样品和对照加入相应的孔中。通常,样品在PBS中以10ng-10μg/孔的范围稀释(测定越敏感,需要的样品越少)。
- 室温孵育平板1小时。
- 去除样品或对照溶液。用洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤平板3次。
检测抗体的结合
- 稀释酶标记的检测抗体。
- 每孔加入0.2ml适当稀释的检测抗体。
- 室温孵育平板30分钟。
- 去除检测抗体溶液。用洗涤缓冲液(PBS-T)洗涤平板3次。
- 加入合适的底物溶液。
- 让平板显色(通常30分钟)并添加终止溶液(可选)。
- 在酶标仪上以适当的波长读取吸光度。