酶促检测罗马蜗牛和牛肝脏来源ß-葡萄糖醛酸酶(EC 3.2.1.31)

1.目标

建立酶促检测ß-葡萄糖醛酸酶¹的标准化操作步骤。

2.适用范围

适用于可检测罗马蜗牛和牛肝脏来源ß-葡萄糖醛酸酶的所有产品。

3.定义

在pH 5.0、温度37 °C条件下，一单位sigma或改良的“Fishman”每小时可从苯酚葡萄糖醛酸中释放出1.0 mg酚酞。

4.讨论

PheP-Gluc + H₂O ^{b-葡萄糖醛酸酶} >D-葡萄糖醛酸脂 + 酚酞

缩写：
PheP-Gluc = 葡萄糖醛酸苯酚

5.责任

应由经过培训的分析服务实验室人员负责按照书面规定执行此程序。

6.安全

有关危险和适当的操作注意事项，请参阅安全数据说明书(SDS)。

7.操作流程

7.1 条件：
T = 30°C，pH = 5.0，A_540nm，光程 = 1 cm

7.2 方法：
光谱法终止测定

7.3 试剂：

7.3.1    100 mM乙酸钠缓冲液，在37 °C条件下的pH值为5.0
采用醋酸钠三水合物和去离子水制备50 mL。采用1 M HCl将pH在37°C下调至5.0。

7.3.2    1.2 mM 葡萄糖醛酸苯酚底物溶液(PheP-Gluc)
采用8 mL去离子水稀释1 mL葡萄糖醛酸苯酚（库存号105-4）而制备

7.3.3    200 mM 甘氨酸缓冲溶液，pH 10.4
（采用去离子水和无甘氨酸碱（货号G7126）制备100 mL。在37°C下用1 M NaOH调节至pH 10.4。）

7.3.4    0.2% (w/v) 氯化钠溶液 (NaCl)
（采用氯化钠和去离子水制备20 mL。）

7.3.5    b-葡萄糖醛酸酶溶液
（须现用现配，采用低温试剂7.3.4配制含250-500 units/mL b-葡萄糖醛酸酶的溶液）

7.3.6    95% (v/v) 乙醇
（采用去离子水和200 Proof USP乙醇配制20 mL。）

7.3.7    0.05% (w/v) 酚酞标准溶液（标准样溶液）
（通过在试剂7.3.6中溶解1.0 mg酚酞制备2 mL）

7.4 反应体系：

7.4.1    将下列试剂(ml)加入适宜的培养皿中：

7.4.2    倒置混匀，恢复至37 °C，然后添加：

7.4.3    倒置混匀并在37 °C下孵育整整30分钟。然后添加：

7.4.4    立即倒置混匀。将溶液转移到适宜的容器中，使用适宜的分光光度计记录试样和空白样的A_540nm。

7.4.5    标准曲线：

将以下试剂加入适宜的容器中，根据加样量(ml)绘制标准曲线：

7.4.6    倒置混匀并将标准样转移到适宜的容器中。使用适宜的分光光度计记录各标准样的A_540nm。

8.计算

8.1    标准曲线：

标准样ΔA₅₄₀ = 标准样_A540 - 标准空白样 A₅₄₀
通过比较标准样和酚酞的mg 数，绘制ΔA₅₄₀标准曲线。

8.2    样品测定：

样品ΔA₅₄₀ = 样品A₅₄₀ - 空白样A₅₄₀
通过标准曲线确定释放的总酚酞量（mg）。

2 = 依照单位定义，从30分钟至1小时的换算系数
df = 稀释因子
0.1 = 所用的酶体积(ml)

9.最终检测体系浓度：

在1.50 mL反应混合物中，终浓度为47 mM 醋酸钠、0.56 mM 葡萄糖醛酸酚酞和25-50单位b-葡萄糖醛酸酶。

11.注意

11.1    此检测方法不可用于检测结合在琼脂糖珠上的不可溶b-葡萄糖醛酸酶。

11.2  此检测方法基于引用文献内容。

11.3    历史记录证明产物非常稳定。

11.4    可使用P9750 作为酚酞标准液或标准溶液105-1（以便利为准）。

11.5    我们担保上述操作步骤信息为我们的质量控制团队所用，且我们的产品与该出版物上的信息吻合。购买者必须自行判定相关信息的适用性和产品对于特定用途的适用性。购买时，请参阅发票背面或装箱单上的附加销售条款及条件。

12.审批