醇脱氢酶（EC 1.1.1.1）的酶学测定

描述

该方法适用于醇脱氢酶产物，但不溶形式的醇脱氢酶（货号A2529）除外。

连续分光光度法测定（A₃₄₀，光路= 1 cm）是基于以下反应：

β-NAD = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，氧化
β-NADH = β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原

单位定义：一个单位的醇脱氢酶在pH 8.8、25℃下，每分钟将1.0 μmole乙醇转化为乙醛。

所需试剂和设备

磷酸（货号438081）
焦磷酸四钠 十水化合物（货号221368）
乙醇95％（v/v）（货号493538）
β-NAD水合物（货号N6522）
磷酸一氢钠（货号S9638）
5 M磷酸一氢钠（货号74092）
磷酸二氢钠（货号S9763）
0.5 M磷酸二氢钠（货号94046）
牛血清白蛋白（货号A9647）

注意事项

请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。

制备说明

使用超纯水（25 °C时 ≥ 18 MΩ×cm电阻率）制备试剂。

9.5％（v/v）磷酸 — 在纯水中制备0.095 mL/mL磷酸（货号438081）溶液。

50 mM磷酸钠缓冲液，pH 8.8（25℃） — 在超纯水中制备22.3 mg/mL焦磷酸四钠 十水化合物（货号221368）溶液。在25℃下用9.5％（v/v）磷酸将pH调节至8.8。

乙醇95％（v/v）（货号493538）

15 mM β-NAD（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）溶液 — 在超纯水中制备11.6 mg/mL的β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物（货号N6522）溶液。

10 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5（25℃）— 制备500 mL缓冲液：加入21.0 mL 0.2 M磷酸二氢钠溶液，该溶液由0.5 M磷酸二氢钠溶液（货号94046）制备而来。然后加入4.0 mL 0.2 M磷酸一氢钠溶液，该溶液由5 M磷酸一氢钠溶液（货号74092）制备而来。最后用超纯水定容500 mL。在25 °C下用1 M NaOH或1 M HCl将pH值调节至pH 7.5。

酶稀释液（10 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.5，含0.1％（w/v）牛血清白蛋白）— 在10 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.5）中制备1 mg/mL牛血清白蛋白（货号A9647）溶液。 用1 M NaOH或1M HCl将pH调节至7.5（25°C）。

ADH原液 — 在pH 7.5的冷（2-8°C）10 mM磷酸钠缓冲液中制备1 mg/mL醇脱氢酶溶液。
注意：新鲜制备

ADH工作溶液 — 在使用前，立即用冷酶稀释液将0.050 mL ADH原液稀释至25.0 mL。
注意：新鲜制备

注意：如果该酶浓度产生ΔA₃₄₀/分钟 > 0.15，则用冷酶稀释液将0.050 mL ADH原液稀释至50.0 mL。如果测定粗产物，则仅相应修改酶稀释方案。

操作流程

在3.00 mL反应混合物中，最终浓度为22 mM焦磷酸钠，3.2％（v/v）乙醇，7.5 mM β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，0.3 mM磷酸钠，0.003％（w/v）牛血清白蛋白，和0.001-0.002 mg/ml醇脱氢酶。

1.在合适的比色皿中，准确移取以下物质：

2.倒置混合。将比色皿放入适当恒温的分光光度计中平衡至25℃。

3.然后添加：

4.立即通过倒置混合，并记录6分钟内的A₃₄₀增量。

5.对于测试和空白，使用1-6分钟的范围获得A₃₄₀/分钟。

结果

计算

1.

3.0 = 测定的总体积（mL）
     df = 稀释因子
     6.22 = 在340 nm处的毫摩尔β-NADH消光系数
     0.1 = 使用的酶溶液的体积（mL）

2.