四唑盐法(MTT)细胞活力和增殖检测方案

• 细胞增殖试剂盒I（MTT）
• 细胞毒性检测方案
• 细胞生长检测方案

四唑盐(MTT)法通过检测细胞代谢活性指示细胞存活、生长增殖和毒性状态。这种比色法的原理是代谢活性细胞可将黄色的四唑盐（3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑或MTT）还原为紫色的甲臜(Formazan)结晶物（图1）。^6,7,35活细胞中的NAD(P)H依赖性氧化还原酶负责将MTT还原为甲臜。³⁶用溶解液溶解不溶性甲臜结晶物，可在微孔板分光光度计下测定溶液在500-600纳米波长处的光吸收值，实现定量。溶液颜色越深，代表具有代谢活性的活细胞数目越多。

这种非放射性的MTT比色法由Mosmann, T等人首先提出，¹其后经过多名研究人员改良。^2-6MTT细胞增殖检测试剂盒I是优化的MTT测定试剂盒，由即用型试剂组成，无需洗涤步骤或额外试剂。可快速方便地检测大量样品。MTT细胞增殖检测试剂盒适合多种应用，包括：

• 细胞生长和活力的定量分析。^1,3,5-7
• 检测生长因子、细胞因子和营养物质对细胞增殖的影响。^1-3,6,8-12（见图3）。
• 细胞毒性检测。例如，定量分析肿瘤坏死因子a或b的细胞毒性作用^13,14（图2）或巨噬细胞诱导的细胞死亡^15,16，评估细胞毒性 ^17-34或生长抑制剂作用，如抑制性抗体。
• 细胞激活研究。⁴

MTT细胞增殖检测试剂盒I组分（产品编号11465007001）

MTT试剂

• 即用型，非无菌
• 5瓶，每瓶5 ml MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基溴化四唑）(1X)，5 mg/mL，溶于磷酸盐缓冲液(PBS，806552)

溶解液

• 1X，即用型
• 3瓶，每瓶90 mL

细胞毒性检测方案

自备试剂：

• 培养基，例如RPMI 1640培养基(R0883)，添加10%热灭活FCS（胎牛血清，12106C），2 mM谷氨酰胺(G6392)和1 μg/mL放线菌素C1（放线菌素D，A9415）。
• 如用到抗生素，在培养基中再添加青霉素/链霉素或庆大霉素
• 人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)(10 μg/mL)，无菌(T6674)。

步骤：

用于测定人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α, T6674)对WEHI-164细胞（小鼠纤维肉瘤，87022501）的毒性作用（见图2）。

1. 用培养基（含1 μg/mL放线菌素C1）将WEHI-164细胞配成1 × 10⁶ cells/ml浓度，在37 °C和5-6.5% CO₂下先培养3 h。
2. 将细胞接种到微孔板（组织培养级，96孔，平底），接种密度5 × 10⁴ cells/孔，100 μl培养基，其中含1 μg/mL放线菌素C1和不同含量的hTNF-α（例如，终浓度0.001–0.5 ng/mL）。
3. +37 °C和5-6.5% CO₂下培养24 h。
4. 培养后，每孔加入10 μl MTT标记试剂（终浓度0.5 mg/ml）。
5. 将微孔板放在加湿环境中（例如，+37 °C, 5-6.5% CO₂）孵育4 h。
6. 每孔加入100μl溶解液。
7. 微孔板置于培养箱，在加湿条件下（例如，+37 °C, 5-6.5% CO₂）孵育过夜。
8. 确保紫色甲臜结晶物充分溶解，在微孔板酶标仪中测定样品吸光度值。根据所用酶标仪的滤光片配置，选择550至600 nm间的某处波长测定甲臜产物的吸光度值。参比波长(reference wavelength)应超过650 nm。

细胞生长检测方案

自备试剂

• 培养基（例如，DMEM，产品编号D5671），添加10%热灭活FCS（胎牛血清，产品编号12106C）
• 2 mM谷氨酰胺（产品编号G6392）
• 0.55 mM L-精氨酸（产品编号A8094） 
• 0.24 mM L-天冬酰胺一水物（产品编号A4284）
• 50 μM 2-巯基乙醇（产品编号M3148）， 
• HT培养基补充物（产品编号H0137）(1×)，含0.1 mM次黄嘌呤和16 μM胸苷。如用到抗生素，在培养基中再添加青霉素/链霉素或庆大霉素。 
• 人白细胞介素-6（hIL-6，产品编号SRP3096）(200,000 U/mL, 2 μg/mL) ，无菌

步骤

用于测定人白介素-6(hIL-6)对7TD1细胞（鼠-鼠杂交瘤细胞，DSMZ，ACC 23）的增殖刺激作用（见图3）。

1. 将7TD1细胞接种到微孔板（组织培养级，96孔，平底），接种密度2 × 10³ cells/孔，100 μl培养基，其中含不同含量的IL-6【例如，终浓度0.1-10 U/mL (0.001-0.1 ng/mL)】。
2. +37 °C和5-6.5% CO₂下培养4天。
3. 培养后，每孔加入10 μl MTT标记试剂（终浓度0.5 mg/ml）。
4. 将微孔板放在加湿环境中（例如，+37 °C, 5-6.5% CO₂）孵育4 h。
5. 每孔加入100 μL溶解液。
6. 微孔板置于培养箱，在加湿条件下（例如，+37 °C, 5-6.5% CO₂）孵育过夜。
7. 确保紫色甲臜结晶物充分溶解，在微孔板酶标仪中测定样品吸光度值。根据所用酶标仪的滤光片配置，选择550至600 nm间的某处波长测定甲臜产物的吸光度值。参比波长(reference wavelength)应超过650 nm。

相似检测

XTT法和WST-1法也可用于细胞活力和生长增殖的检测。