Prestige Antibody^®免疫荧光检测步骤

ICC-IF实验方案

下述实验方案采用Prestige Antibodies^®进行免疫细胞化学(ICC) -免疫荧光(IF)亚细胞定位研究。除一抗外，每一张图片中还采用了一组参照标记：针对微管的抗体标志物以及核染料DAPI。

样品制备

所有洗涤都在室温下进行。

1. 使用纤维连接蛋白（12.5 μg/mL浓度）对适用于细胞培养及高分辨率荧光成像的多孔玻璃底平板室温包被1小时。
2. 进行细胞接种（每孔10,000-25,000细胞）并在带有5.0% CO₂的37°C湿润空气环境下培养20-24小时。

免疫染色

1. 去除生长培养基并用 PBS (8.1 mM Na₂HPO₄, 1.5 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.2) 洗涤细胞。
2. 用在PBS中制备的4%多聚甲醛固定细胞15 min。
3. 用0.1% Triton X-100 PBS溶液对细胞通透处理10 min。
4. 用PBS洗涤细胞一次并在封闭缓冲液中（4% FBS的PBS溶液）室温孵育1 h以封闭非特异性位点。
5. 在封闭液中将细胞用一抗4°C孵育过夜。
6. 第一天用PBS洗涤细胞4x10 min并在封闭液中用二抗室温孵育1.5 h。
   注意：二抗是通过荧光标记的，因而具有光敏感性。样品保存及后续操作必须保持弱光条件。
7. 细胞用1 μg/mL核染料DAPI 1PBS溶液中复染5 min。
8. 细胞用PBS洗涤4x10 min并在含有0,02 % (w/v) NaN₃的PBS中封固。

一抗：

• 一抗，工作浓度1-4 μg/mL。
  注意：一抗稀释比例仅作参考。最佳的稀释比例须由用户自行确定。
• 小鼠抗α-微管蛋白单抗(货号：T9026)，稀释500x用于多克隆抗体。
• 小鼠抗α-微管蛋白单抗克隆DMI1A (货号：T9026)，用于单克隆抗体。

二抗：

抗兔IgG和抗小鼠IgG荧光染料偶联的二抗。