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主页流式细胞术Prestige Antibody® 免疫荧光检测步骤

Prestige Antibody® 免疫荧光检测步骤

ICC-IF实验方案

下述实验方案采用Prestige Antibodies®进行免疫细胞化学(ICC) -免疫荧光(IF)亚细胞定位研究。除一抗外,每一张图片中还采用了一组参照标记:针对微管的抗体标志物以及核染料DAPI。

样品制备

所有洗涤都在室温下进行。

  1. 使用纤维连接蛋白(12.5 μg/mL浓度)对适用于细胞培养及高分辨率荧光成像的多孔玻璃底平板室温包被1小时。
  2. 进行细胞接种(每孔10,000-25,000细胞)并在带有5.0% CO2的37°C湿润空气环境下培养20-24小时。

免疫染色

  1. 去除生长培养基并用 PBS (8.1 mM Na2HPO4, 1.5 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 7.2) 洗涤细胞。
  2. 用在PBS中制备的4%多聚甲醛固定细胞15 min。
  3. 用0.1% Triton X-100 PBS溶液对细胞通透处理10 min。
  4. 用PBS洗涤细胞一次并在封闭缓冲液中(4% FBS的PBS溶液)室温孵育1 h以封闭非特异性位点。
  5. 在封闭液中将细胞用一抗4°C孵育过夜。
  6. 第一天用PBS洗涤细胞4x10 min并在封闭液中用二抗室温孵育1.5 h。
    注意:二抗是通过荧光标记的,因而具有光敏感性。样品保存及后续操作必须保持弱光条件。
  7. 细胞用1 μg/mL核染料DAPI 1PBS溶液中复染5 min。
  8. 细胞用PBS洗涤4x10 min并在含有0,02 % (w/v) NaN3的PBS中封固。

一抗:

  • 一抗,工作浓度1-4 μg/mL。
    注意:一抗稀释比例仅作参考。最佳的稀释比例须由用户自行确定。
  • 小鼠抗α-微管蛋白单抗(货号:T9026),稀释500x用于多克隆抗体。
  • 小鼠抗α-微管蛋白单抗克隆DMI1A (货号:T9026),用于单克隆抗体。

二抗:

抗兔IgG和抗小鼠IgG荧光染料偶联的二抗。