酵母因能够快速生长并具有分散的细胞而被认为是用于真核生物研究的模范系统。此外,可以相对容易地完成酵母细胞的复制铺板和突变分离,并且它们也具有明确的遗传系统。最为重要的是,酵母具有高度多功能的DNA转化系统,可有效用于蛋白质的生产。
LiAc转化方法涉及到三个主要的步骤:制备感受态酵母细胞、用质粒DNA进行转化以及随后的铺板以进行转化子选择。酵母转化子通常是通过使用营养缺陷型标记而进行选择的;因此,应使用合适的合成缺陷型培养基进行转化子筛选。
储备溶液
50%聚乙二醇溶液(分子量~36,500)
1 M Tris-HCl和0.2 M EDTA,pH 8.0(TE缓冲液)(货号T9285)
1 M醋酸锂,pH 7.5(货号L4158)
1x TE-LiAc溶液
含1 mM EDTA和0.1 M醋酸锂的10 mM Tris-HCl,pH 8.0
PEG-TE-LiAc溶液
溶于含1 mM EDTA和0.1 M醋酸锂的10 mM Tris-HCl,pH 8.0的40 % PEG
注意:可参考铺板酵母的生长实验方法以及以下章节进行转化子分离。
酵母转化子通常是采用URA3互补法进行选择的,尽管也可以使用利用氨基酸进行互补的技术和蓝白斑筛选方法。
在基于URA3的选择技术中;质粒DNA通过都含有正常拷贝的酵母URA3基因以及URA3启动子;然而,酵母突变株缺乏URA3等位基因。因此,用质粒转化后的酵母细胞含有了URA3基因的功能性拷贝,使得它们能够在补充了尿嘧啶(货号Y1501)的酵母合成缺陷型培养基中进行生长。
图1.酵母转化
如要继续阅读,请登录或创建帐户。
暂无帐户?