背景
在涉及ZFN和CRISPR/Cas核酸酶的多种基因组编辑实验中，首要挑战在于实现质粒的成功递送和所编码的核酸酶的后续表达。虽然最终也需要使用CEL-1测定、T7E1测定或深度测序来对核酸酶诱导的插入和缺失（indels）进行定量，但实验的故障排除可以通过一种可快速报告核酸酶表达盒活性的方法而更快进行。我们开发了一种Cas9-GFP表达盒，可加速从初始核酸酶筛选到单细胞克隆最后阶段的基因组编辑工作流程。该载体还包括一个U6-gRNA盒，可创建用于CRISPR/Cas递送和表达的单载体系统（图1）。
某些细胞类型和/或基因组位置比其他更难被核酸酶靶向。对于CRISPR转染需要反复尝试以及检测未能实现高水平切割的情况，对编辑的细胞进行富集可能会有用。通过使用我们的单载体系统，来自同一mRNA的共表达Cas9和GFP实现了可通过荧光活化细胞分选（FACS）而对具有所需的基因组编辑的细胞系进行富集的可能性。通过能够使用FACS而基于GFP进行检测和富集，它显著减少了与基因组编辑应用中单细胞克隆和基因分析相关的工作和成本。以下数据集解释了我们的单载体系统如何用于低、高水平切割的表达监测和FACS富集。
图 1.CRISPR/Cas-GFP载体的示意图。
图 2.在现有的大多数CRISPR应用中，gRNA和Cas9都是表达自两个不同的载体。当转换为单一载体形式后，针对人KRAS基因座的gRNA设计显示出了在人K562细胞中保留对插入缺失高水平的诱导。单质粒GFP的形式可确保所有所需的CRISPR/Cas成分（如Cas9和gRNA编码序列）都能有效地递送至GFP阳性细胞中。
图 3.Cas9-GFP表达盒的递送可通过显微镜或FACS轻松进行监测。这种特定载体使用的是CMV启动子来驱动Cas9-GFP盒的表达，尽管CMV可用于多种常用细胞类型，但它并不是普遍都具有活性的。例如，之前的ZFN项目已显示CMV启动子在HeLa细胞中并不具有高活性（内部未发表数据）。为了解决HeLa中的这一问题，已采用ZFN mRNA作为基因组编辑应用中瞬时表达ZFN的一种有效的替代方法。如果在反复尝试后仍无法在特定的细胞类型中观察到GFP表达和核酸酶的插入/缺失活性，则可选择使用Cas9-GFP mRNA来避免启动子/细胞类型的不兼容。这里所描述的单载体系统含有一个T7启动子用于Cas9-GFP mRNA的体外转录（图1）。
图 4.当如图3所示将细胞基于GFP的表达分为低、中、高三类时，相应的插入/缺失活性提高也能被观察到。对于靶向KRAS基因座的gRNA，当把未分选的群体与GFP表达最高的前2％细胞进行比较时，可观察到4倍的插入/缺失活性提高。当针对基因靶标进行初始核酸酶筛选时，并非所有的靶向gRNA设计都能产生可检测到的插入/缺失活性，而当前的gRNA设计规则也无法根据序列内容或基因组的背景对活性进行预测。我们拿到了一个靶向CCR5的gRNA设计（它起始并没有能够产生可检测的插入/缺失活性），并将其分选成了低、中、高GFP三类。在中和高GFP的两类中可检测到插入/缺失活性。该技术对于挽救那些切割位点位于与供体DNA具有最佳兼容性位置（如接近疾病SNP）的gRNA设计的活性会非常有用。
结论
该Cas9-GFP表达盒可提供高水平的基因组标记活性、快速的表达检测，并可选择对起初未能产生可检测到的插入/缺失活性的gRNA设计进行富集和挽救。通过使用我们的单质粒设计，它能确保所有的GFP阳性细胞也都具有所需的CRISPR/Cas成分。GFP报告子可实现转染效率的快速检测，节省了与下游表达定量检测相关的时间和成本。这也使得针对与特定细胞类型相关的质粒递送和表达问题的快速故障排除成为可能。我们的CRISPR/Cas技术可提供快速、可承担的靶向基因组编辑方案，使得更多的实验室比以往任何时候都更容易接触到基因组编辑。
如要继续阅读，请登录或创建帐户。
暂无帐户？