Cultrex^® 3-D Culture Matrix™大鼠胶原I实验方案

货号 3447-020-01

I. 产品描述

3-D培养是一种对早期肿瘤发生对三维微环境的形态学影响进行建模的创新型方法。当健康、正在分化的细胞展现出了一种对细胞的形成和功能至关重要的结构化、极化形态。在癌症的发展过程中，与细胞发育、增殖和死亡相关的细胞周期控制发生了丢失，导致了这些结构被破坏。实际上，这些结构的形态可用作研究早期癌症发展因素的一种手段。在标准化的尝试中，J. Debnath等发表了使用MCF-10A乳腺上皮细胞作为模型进行该测定的指南。¹ Cultrex^® 3-D Culture Matrix™产品线可提供专为3-D培养研究而生产并认证的试剂。3-D Culture Matrix™胶原I可单独或与其他基底膜成分一起用作在其上生长细胞的凝胶或培养基添加剂，用于研究体外三维的细胞生长和分化。

I型胶原蛋白是在结缔组织和内部器官中发现的细胞外基质的主要结构成分，但其在真皮、肌腱和骨骼中最为普遍。它是一个300 kDa的分子，由两条alpha1（I）链和一条alpha2（I）链组成，它们在中性pH和37 °C下可自发形成一个三螺旋的支架。这种现象可在发育过程中被用于促进细胞附着、生长、分化、迁移和组织形态发生。为了提供用于3-D培养的最标准化胶原蛋白I，采用一种特殊工艺来提供约5 mg/mL标准浓度的材料。该材料随后可被掺入到3-D培养中以验证功效。

II.产品规格

1. 浓度：以5 mg/mL提供的I型胶原蛋白（Sircol测定）
2. 来源：大鼠尾肌腱
3. 储存液: 20 mM醋酸

III.需自备的试剂和设备

1. 设备
   1. 超净台
   2. 37 °C CO₂培养箱
   3. 低速摇摆斗4 ⁰C离心以及用于细胞收集的管子
   4. 细胞计数板或其他细胞计数方法
   5. -20 °C保存
   6. 冰桶
   7. 移液器及助吸器
   8. 带有4X物镜及数码照相机的明场显微镜
2. 试剂
   1. 目的细胞系
   2. 细胞收集缓冲液；EDTA，胰酶或其他细胞粘附缓冲液
   3. 组织培养生长培养基
   4. 可加入细胞培养基中的药物试剂（如有必要）
   5. 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（货号P5493）用于洗涤细胞
   6. 无菌1N NaOH（货号S2770）
   7. 无菌7.5%碳酸氢钠（货号S8761）
   8. 无菌蒸馏水（货号W35133）
3. 一次性耗材
   1. 经组织培养处理的Greiner培养瓶，25 cm²（货号C6231）或 75 cm²（货号C7106）
   2. 离心管, 10 mL（货号SIAL0790）和50 mL (货号SIAL0828)
   3. 血清移液器，1、5和10 mL (货号 SIAL1485、SIAL1487和SIAL1488)
   4. 手套

IV.注意事项和限制

1. 仅供研究使用。不可用于诊断流程。
2. 这些产品的物理、化学和毒理学性质尚不完全明确；因此，我们建议在处理这些化学试剂时穿戴手套、实验服和护目镜。

V. 材料认证

1. 功能测定
   1. 细胞附着 – 已测试其促进HT-1080人纤维肉瘤细胞附着和扩散的能力。
   2. 3D培养 – 胶原蛋白I可促进鼠内皮SVEC4-10细胞的附着和生长。
2. 无菌测试
   1. 根据USP XXIV第71章无菌测试指南操作，在37 °C孵育14天后，未检测到细菌和真菌生长
   2. PCR未检测到支原体污染
   3. LAL测试显示内毒素浓度≤20 EU/mL
3. 凝胶
   1. 当稀释至0.4 mg/mL时，I型胶原蛋白在中性pH和37 °C下可形成牢固的凝胶。

VI.储存方法和稳定性

产品储存在4 °C条件下可稳定至少3个月。避免反复冻融。

凝胶实验方案I

1. 为了防止污染，整个过程中都请在层流生物通风橱中保持无菌技术。使用在4 °C下预冷的溶液并将溶液置在冰上，可以延长中和后胶原蛋白I保留为溶液形式的时间。
2. 材料是以1 mg/mL进行认证的，并且这也是推荐的工作浓度。
3. 将以下试剂置于冰上：
   1. I型胶原蛋白（5 mg/mL）
   2. 无菌10X PBS
   3. 无菌蒸馏水
   4. 无菌1N NaOH（新鲜）
4. 确定浓度以及实验所需的胶原蛋白终体积。
5. 确定所需的试剂量，以便胶原蛋白I在用1N NaOH中和的1X磷酸盐缓冲液（PBS）中达到所需的浓度：

4. 在一支无菌管中将10X PBS、1N NaOH以及dH₂O进行混合。
5. 向管中加入胶原蛋白I并吹打混匀（不要涡旋）。
6. 将胶原蛋白溶液放入所需的平板或皿中。溶液可在冰上稳定一小时。平板可在4 °C 300 x g离心10分钟，以防止凝胶中形成气泡。
7. 将平板在37 °C下孵育1小时以促进凝胶形成。

VIII.凝胶实验方案II

对于某些细胞类型，可能更适合于采用7.5% (w/v)碳酸氢钠中和的凝胶过程。

1. 将以下试剂置于冰上：
   1. I型胶原蛋白（5 mg/mL）
   2. 无菌10X PBS
   3. 无菌蒸馏水
   4. 无菌7.5%碳酸氢钠
2. 确定浓度以及实验所需的胶原蛋白终体积。
3. 确定所需的试剂量，以便胶原蛋白I在用7.5%碳酸氢钠中和的1X磷酸盐缓冲液（PBS）中达到所需的浓度。

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  3. 所需的7.5%碳酸氢钠体积 = （胶原蛋白体积，步骤a）X 0.0125 mL
  4. 所需的蒸馏水体积 = 总体积 - （来自步骤a+b+c的体积总和）

4. 在一支无菌管中将10X PBS、dH₂O和7.5%碳酸氢钠进行混合。
5. 向管中加入胶原蛋白I并吹打混匀（不要涡旋）。
6. 将中和的胶原蛋白I溶液放入所需的平板或皿中。溶液可在冰上稳定一小时。平板可在4 °C 300 x g离心10分钟，以防止凝胶中形成气泡。
7. 将平板在37 °C下孵育1小时以促进凝胶形成。

IX.高浓度胶原蛋白凝胶实验方案

1. 将胶原蛋白I（5 mg/mL）、7.5%碳酸氢钠溶液、无菌管和细胞培养板置于冰上。
2. 将必要量的胶原蛋白I加入至无菌管中。
3. 按每0.1 mL胶原蛋白I（5 mg/mL）加入5 μL 7.5%碳酸氢钠。
4. 吹打混匀（不要涡旋）。
5. 将中和后的胶原蛋白放入细胞培养板中。平板可在4 °C 300 x g离心10分钟，以防止凝胶中形成气泡。
6. 将平板在37 °C下孵育1小时以促进凝胶形成。

通过加入a）0 mg/mL、b）1 mg/mL和c）2 mg/mL的3-D Culture Matrix™ Laminin-1，在3-D Culture Matrix™胶原I上培养的乳腺上皮细胞MCF-10A被诱导发生了分化。

法律信息

3-D Culture Matrix是Trevigen, Inc.公司的商标。
Cultrex是Trevigen, Inc.公司的注册商标。