SeqPlex RNA扩增试剂盒可在进入常用深度测序平台工作流程之前为总RNA或分离后的mRNA提供一种扩增方法,在8小时或更短的时间内从低纳克至皮克级总RNA生成微克级的双链cDNA,适合对组织、培养细胞、福尔马林固定的样品或血清中分离的RNA(包括不含polyA尾的RNA)进行扩增,并同时保持未扩增样品中所发现的差异表达模式。
测序准备包括三个步骤。首先,用具有半简并3'末端以及指定通用5'末端的引物对样品RNA进行逆转录。随着DNA聚合进行,置换的单链可作为引物退火和延伸的新模板。接下来,由侧翼为单个通用引物序列的随机重叠片段组成的双链cDNA文库产物,在优化的PCR条件下扩增生成WTA(全转录组扩增)产物。从纳克级完整起始RNA开始,大部分的扩增产物大小范围为200至400 bp。对于受损的RNA和皮克级高质量RNA,可得到150至250 bp大小范围。最后,将SeqPlex扩增RNA与深度测序工作流程整合需要消除每个扩增子的引物序列。在样品制备之前需要完成有效的引物去除步骤。
除了深度测序外,SeqPlex扩增产品还可适用于芯片靶标或qPCR模板——无论是否进行引物去除
SeqPlex RNA扩增试剂盒组分 |
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所有组分应储存在-20°C条件下。解冻使用时,所有组分应保存在冰上。
该试剂盒中的试剂已经过测试确保不存在RNase。但用户必须穿戴基本的防护装备——包括手套和实验服——以保护实验结果的完整性。在整个过程中所有试剂的转移都应在层流罩或专用洁净室中进行。 冷冻RNA样品应在冰上进行解冻。
Sigma-Aldrich SeqPlex RNA扩增试剂盒 (SEQR)、SeqPlex DNA扩增试剂盒(SEQX)TransPlex® WTA试剂盒、完整全转录组扩增试剂盒(WTA2) 以及GenomePlex® WGA试剂盒中的某些成分具有相似命名。尽管它们功能大体相同,但不能替换使用。另外,熟悉WTA2试剂盒的用户请注意:
SeqPlex RNA扩增试剂盒可在扩增后高效去除引物序列。这些引物序列占扩增产物质量30-50%并可通过纯化除去。因此,引物去除反应的扩增产物加入量应是2倍测序所需量。
测序所需的核酸量具有平台特异性,Roche 454最低需要~1 µg起始核酸。Illumina MiSeq和HiSeq平台仅需50 ng,与ABI SoLiD一样。因此,此处提供的实验过程是基于最终引物去除反应后的1 µg产量。
为了确保可生成足够量的扩增RNA,请咨询您的测序服务供应商并对您的引物去除反应进行相应的放大。
以100pg至5ng高质量总RNA(RIN > 8.0)开始时,单次扩增反应将产生2-4 mg扩增的双链cDNA。提高RNA模板起始量和质量通常会使产量增加。对于受损RNA——如从FFPE(福尔马林固定石蜡包埋)样品中分离的RNA——建议使用1-50 ng的起始RNA。 可以按比例放大或缩小反应体积以适应最终产物所需量的制备。
在扩增之前必须进行基因组DNA去除。如果这一步没有在RNA提取时完成,请按照操作说明以及最方便的文库合成规模使用产品AMPD-1 RNase-free DNase。
尽管扩增效率低于信使RNA,SeqPlex RNA 扩增试剂盒也可扩增核糖体RNA。尽管扩增效率低于信使RNA,SeqPlex RNA 扩增试剂盒也可扩增核糖体RNA。
5µL最终推荐反应体积的文库合成如下所描述。但通过对于处在早期指数扩增、扩增产量或β-actin转录水平(参见下面的“质量控制,产品保留”)的Ct值检测,2.5至25 µL的体积变化范围(同时保持75 µL扩增反应体积)并未显示出对于扩增的影响。确保对要比较的所有样品使用相同的文库合成体积。已提供足够的试剂用于试剂盒25 µL文库合成体积的指定数量反应。在推荐实验过程之后也提供了针对更高反应规模的可选设置建议。
文库合成
扩增
引物去除
引物去除会造成少量或不会造成扩增产物损失。然而,建议采用加入了2 µg扩增产物的75 µL引物去除反应物以生成1µg的最终 产物,以进入深度测序的工作流程。(参见上文“针对下游测序的考虑因素”。)这一步可能会造成因为引物去除损失以及反应纯化过程中的其他任何额外损失。此外,还请对每个扩增的样品进行“无酶”对照反应。 需要对照反应来检测引物序列的去除(参见下文质检部分)。
注意:注:在进行引物去除后扩增产物不能再被进一步扩增。
注意:试剂盒中已含有用于75 uL“无引物去除酶”对照反应的足量试剂。 然而,您也可能会希望如下所示通过降低“无酶对照”体系规格来节省试剂及扩增产物。
注意:第15步中所描述的反应体系可用于引物去除反应以及(第16及17步中的)无酶对照。
扩增产物大小
对扩增后的完整总RNA进行Agilent Bioanalyis可显示出弥散以及范围在200至400 bp之间的主条带。受损RNA或低质量起始RNA的类似分析将会获得150至250 bp之间的范围。
引物去除
可采用5X扩增预混液和扩增酶结合qPCR预测引物去除效率。 可使用未纯化的引物去除反应以及相应的对照反应进行这些检测(第20步)。试剂盒中已含有用于引物去除反应以及“无引物去除酶”对照反应的15 uL qPCR检测所需的足量扩增预混液和酶。每种引物去除剂对照反应的1/1,000,000稀释液将用于该检测。引物去除的效率预计高于90%。
针对引物去除QC,将以下试剂的量用于单次qPCR反应:
3 µL 5X扩增预混液(A5112)
0.15 µL扩增酶(5237)
1.85 µL 1/10,000稀释液,SYBR的10 mM Tris-HCl溶液,pH 8.0(货号T3038)
10 µL 1/1,000,000 DNA稀释液(来自引物去除反应或无酶对照)
扩增条件:
1个循环
94 ° C,2.5分钟
40个循环
94 °C,30秒
70 °C,5分钟(读取)
理想的引物去除预计得到3-7的ΔCt结果:
(Ct)无引物去除酶 – (Ct)加上引物去除的酶
注意:可以在必要时进行单独的引物去除QC测试反应,以及制备试剂混合液的多个反应(推荐)。要移取指定少量溶液,请使用体积范围适当的移液器并使用硅化或低保留移液器吸头。在加样试剂前,确认通过离心将在储存过程中可能发生的任何冷凝液进行收集并通过涡旋、吹打或倒置正确混匀。
注意:已有结果表明通过该检测得到的预计引物去除比例与相应的测序结果之间存在关联。
扩增产物保留(可选)
为了证明在引物去除期间扩增产物保留,需要使用一对匹配相应源样品中已知表达的转录本的引物,进行额外的qPCR反应。在实验设置中需包括无酶对照反应(参见引物去除QC)。
(对于人类RNA样品,已知表达b-肌动蛋白时,可使用以下的引物)
5’-CGGGACCTGACTGACTACCTC-3’
5’-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3’
样品现在便可进入深度测序工作流程。SeqPlex扩增产物的主条带在200至400 bp范围内。尽管通常无必要,但也可通过超声DNA片段化仪器(如Covaris)或基于酶的片段化方法进一步片段化。
每条扩增子都具有5’-磷酸化以及3’端2个碱基的突出。在进行测序引物连接之前,采用T4聚合酶对双链片段的两端进行修复。用于Roche 454文库制备的连接产物已被报道包含有序列嵌合体。Illumina的3’-腺苷酸化可基本阻止这种情况的发生。当使用ABI SoLID测序前进行第二步的大小选择将有助于减少嵌合体发生概率。
之前所描述的5-uL“文库合成”是推荐的规格体积。对于不符合该规格的RNA样品体积,可使用以下的反应设置方法。
注意:有些情况下起始RNA量可能未知,例如RNA从极少量细胞中分离时。请注意到达平台期所需的循环数会随着起始RNA质量和数量提高(循环增加)或降低(循环减少)而变化。
下面的表格提供了第2步文库合成所需的最佳反应体积。
表2根据第4步文库合成按照表1中确定的反应扩大体积进行设置。
对于第9步扩增,将文库合成反应物全部加入至75-μL扩增反应物中,并相应调整水的体积(表3)。
故障排除指南 |
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