组织蛋白酶B的酶活检测

简介

本实验方案通过Z-Arg-Arg-7-酰胺基-4-甲基香豆素释放7-氨基-4-甲基香豆素检测酶活，适合所有具有组织蛋白酶B活性的产品，例如C0150和C8571货号产品。

组织蛋白酶B是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，可通过广泛的肽键水解蛋白质，但在小分子底物中优先切割Arg-Arg键的羧基端。据悉，溶酶体组织蛋白酶B还可体外降解可溶性胶原单体和不溶性胶原聚合体。

            Nα–CBZ–Arg–Arg–7-酰胺基-4-甲基香豆素 + H2O    组织蛋白酶B   > Arg–Arg + 7–AMC

底物Nα–CBZ–Arg–Arg–7-酰胺基-4-甲基香豆素用于组织蛋白酶B活性的荧光法检测。该底物的Km值为0.39 mM，最适pH为6.0。荧光来自酶促释放的游离氨甲基香豆素。

定义

• 纯水 – 来自去离子系统的水，电阻率>或=18MΩ•cm @25 ºC
• CBZ – 苄氧羰基
• Arg-Arg – 精氨酰精氨酸
• 7-AMC – 7-氨基-4-甲基香豆素
• 单位定义 — 在 40°C、pH 6.0条件下，每分钟从Z-Arg-Arg-7-酰胺基-4-甲基香豆素中释放1 nmol 7-氨基-4-甲基香豆素的酶量定义为一个酶活单位。

操作流程

条件：T = 40 °C, pH = 6.0, 激发波长 = 348 nm, 发射波长 = A_440nm, 光程 = 1 cm

方法：荧光变化速率测定法(Fluorometric Rate Determination)

试剂：

• 缓冲液：含352 mM磷酸钾，48 mM磷酸钠，4.0 mM乙二胺四乙酸，pH 6.0(40 °C)。在纯水中配制47.9 mg/mL磷酸二氢钾（货号P5379），6.8 mg/mL磷酸氢二钠（货号S0876），1.7 mg/mL乙二胺四乙酸（货号ED4SS），再用1 N HCl或1 N KOH调至pH 6.0(40 °C)。
• L-Cys：8.0 mM L-半胱氨酸盐酸盐溶液，pH 6.0(40 °C)。在试剂7.3.1（缓冲液）中配制1.4 mg/ml L-半胱氨酸盐酸盐（例如，货号C7880）。用1 N NaOH调PH至6.0(40 °C)。
• Brij 35：0.1% (v/v) Brij 35溶液。使用30%(w/v)的Brij 35溶液（货号Product No. B4184）在纯水中配制0.1% (v/v)溶液。
• Arg-Arg-7-AMC：0.02 mM Nα–CBZ–Arg–Arg–7-酰胺基-4-甲基香豆素。制备新鲜溶液时，先在二甲基亚砜（货号D5879）中配制7.1 mg/mL Nα–CBZ–Arg–Arg–7-酰胺基-4-甲基香豆素（货号C5429），再用试剂7.3.3(Brij 35)稀释至终浓度0.02 mM，在配制好的3小时内使用。需避光使用溶液。
• 标准溶液：5.0 μM 7-氨基-4-甲基香豆素。先用二甲基亚砜（货号D5879）溶解为1 mg/mL 7-氨基-4-甲基香豆素（货号A9891），再用Brij 35试剂稀释至终浓度5.0 μM。需避光使用溶液。
• 酶：组织蛋白酶B酶液。临用前，用冷的0.1% (v/v) Brij 35溶液配制5-10 单位/mL组织蛋白酶B溶液。

步骤：

检测酶活时，在荧光比色皿中加入下列试剂（毫升）：

颠倒混匀，平衡至40 °C。使用适合的温控荧光计，在激发波长348 nm和发射波长440 nm下，监测荧光强度至稳定。

接着将下列试剂(mL)加入荧光比色皿：

立即颠倒混匀，在激发波长348 nm和发射波长440 nm下，记录在5分钟内增加的荧光强度。取最大的ΔIntensity/min（每分钟的荧光强度差值），对试样和空白样均取最大线性速率。

对于标准曲线制作，在荧光比色皿中加入下列试剂（毫升）：

颠倒混匀，平衡至40 °C。在激发波长348 nm和发射波长440 nm下，检测所有标准溶液和标样空白的荧光强度。

计算方法：

用标准空白值修正标准溶液强度。

    Δ 标准溶液强度 = 标样强度 – 标样空白强度

以每种标准溶液的7-氨基-4-甲基香豆素含量(nanomole)对Δ标准溶液强度绘制标准曲线，得出标准溶液的线性回归方程。

根据线性回归方程计算样品释放的7-氨基-4-甲基香豆素含量(nanomole)：

式中：
    DF = 稀释倍数
    0.100 mL = 酶体积

检测体系终浓度：

在2.50 mL反应液中，各试剂的终浓度为105.6 mM磷酸钾，14.4 mM磷酸钠，1.2 mM乙二胺四乙酸，2.4 mM L-半胱氨酸，0.07% (v/v) Brij 35，0.006 mM Nα–CBZ–Arg–Arg–7–酰胺基–4–甲基香豆素，0.0525% (v/v)二甲基亚砜，0.2 – 0.4单位组织蛋白酶B。