大分子 HPLC

反相生物大分子高效液相色谱

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是一种灵敏而多用途的技术，用于分离和分析蛋白质、蛋白质片段和肽。RP-HPLC 使用非极性固定相和极性流动相。蛋白质和肽在固定相上的保留遵循吸附和分配原则。疏水性蛋白质区域可逆地吸附在固定相上。增加流动相的非极性可洗脱蛋白质。分辨率会受到孔径、粒径、色谱柱长度和固定相上附着的碳氢链的影响。

尺寸排阻色谱（SEC）

尺寸排阻色谱（SEC）是一种非变性色谱模式，通过分子的尺寸（即流体力学半径）来分离分子。这种模式不依赖分析物与固定相的相互作用，而是分析物随机流经固定相颗粒。高分子量的分析物洗脱较早，因为它们被完全或部分地排除在固定相颗粒孔隙之外，而低分子量的分析物洗脱较晚，因为它们要花更多的时间在颗粒中艰难地穿行。SEC 已被用于表征单克隆抗体 (mAbs) 聚集体和片段、估算未知蛋白质分子量以及确定蛋白质配方的稳定性。

疏水相互作用色谱（HIC）

疏水相互作用色谱（HIC）是一种色谱模式，根据疏水分析物分子与疏水固定相配体之间的相互作用程度来分离分析物。由于肽的分子量较低，折叠倾向也较低，因此 HIC 通常不用于肽的分离。在盐浓度较高的情况下，蛋白质水合层可能会被破坏，从而使疏水表面区域与非极性固定相接触。盐的选择由霍夫迈斯特系列决定，该系列根据阳离子和阴离子破坏蛋白质水合层（混沌向性）或促进蛋白质水合层形成（渗透向性）的能力对其进行分类。典型的盐包括硫酸铵、硫酸钾和硫酸钠。疏水相互作用色谱法目前正用于确定抗体药物共轭物（ADC）的药物抗体比（DAR）概况。

离子交换色谱（IEX）

离子交换色谱（IEX）是一种通过电荷分离分析物的色谱模式。蛋白质和肽具有两性，这意味着它们同时具有酸性和碱性功能。酸性蛋白质功能包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和 C 端 α-羧酸盐。基本蛋白质功能包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸和 N 端 α-胺。生物治疗电荷变体可通过 IEX 检测和解析。电荷变异可能源于信使核糖核酸（mRNA）转录本的错误翻译和/或翻译后修饰，如脱氨、氧化或糖基化。

必须根据分析物的等电点（pI）来选择 IEX 色谱柱。

Affinity Chromatography

亲和层析依赖于分析物与固定相配体之间的特异性相互作用。理想情况下，只有感兴趣的分析物与固定相相互作用，所有其他样品成分均可通过色谱柱。

蛋白 A 色谱是生物制药行业最常用的亲和层析形式。 蛋白 A 是一种 42 kDa 的表面蛋白，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。这种蛋白能与 IgG 的 Fc 区域重链特异性结合，因此是将 IgG 与其他样品成分分离的理想机制。 大多数蛋白 A 色谱柱都是通过将蛋白固定在多孔有机颗粒上制成的。 不过，现在已经生产出了用于蛋白 A 色谱的整体式色谱柱，可以在不牺牲效率的情况下以各种流速实现高样品吞吐量。