大分子高效液相色谱

反相生物分子高效液相色谱

反相高效液相色谱（RP-HPLC）是一种灵敏且用途广泛的技术，用于分离和分析蛋白质、蛋白质片段和肽。反相高效液相色谱采用非极性固定相和极性流动相。蛋白质和肽在固定相上的保留遵循吸附和分配原理。疏水的蛋白质区域会可逆地吸附在固定相上。 通过提高流动相的非极性，可将蛋白质洗脱。分离度会受到孔径、颗粒尺寸、色谱柱长度以及固定相所连接的烃链的影响。

尺寸排阻色谱（SEC）

尺寸排阻色谱（SEC）是一种非变性色谱模式，根据分子的大小（即流体动力学半径）对分子进行分离。该模式不依赖于分析物与固定相的相互作用，而是基于分析物在固定相颗粒中随机流动的原理。 高分子量分析物因被完全或部分排斥于固定相颗粒孔隙之外，因此较早洗脱；而低分子量分析物则因在颗粒内蜿蜒曲折的通道中花费更多时间，因此较晚洗脱。SEC已被用于表征单克隆抗体（mAbs）的聚集体和片段、估算未知蛋白质的分子量，以及测定蛋白质制剂的稳定性。

疏水相互作用色谱（HIC）

疏水相互作用色谱（HIC）是一种基于疏水性分析物基团与疏水性固定相配体之间相互作用程度来分离分析物的色谱模式。由于肽类分子量较低且折叠倾向较弱，HIC通常不用于肽类分离。在高盐浓度条件下，蛋白质的水合层可能会被充分破坏，从而使疏水性表面区域与非极性固定相发生接触。 盐的选择遵循霍夫迈斯特系列，该系列根据阳离子和阴离子破坏蛋白质水合层（解构性）或促进蛋白质水合层形成（共构性）的能力对它们进行分类。典型的盐包括硫酸铵、硫酸钾和硫酸钠。 目前，疏水相互作用色谱法正被用于测定抗体药物偶联物（ADC）的药物与抗体比例（DAR）曲线。

离子交换色谱法（IEX）

离子交换色谱（IEX）是一种根据电荷对分析物进行分离的色谱方法。蛋白质和肽具有两性性质，即同时具有酸性和碱性官能团。蛋白质的酸性官能团包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸以及C端α-羧基。 蛋白质的碱性官能团包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸以及N端α-胺基。IEX可检测并分离生物治疗药物的电荷变体。电荷变体可能源于信使RNA（mRNA）转录过程中的翻译错误和/或翻译后修饰，例如脱酰胺、氧化或糖基化。

必须根据待测物的等电点（pI）选择相应的IEX色谱柱。如果流动相的pH值低于pI，待测物将带正电荷并吸附在阳离子交换柱上；如果流动相的pH值高于pI，待测物将带负电荷并吸附在阴离子交换柱上。

亲和色谱

亲和色谱依赖于分析物与固定相配体之间的特异性相互作用。理想情况下，只有目标分析物会与固定相结合，而所有其他样品组分则会通过色谱柱。随后，将第二种流动相通过色谱柱以洗脱分析物。

蛋白A色谱是生物制药行业中最常见的亲和色谱形式。蛋白A是一种分子量为42 kDa的表面蛋白，存在于金黄色葡萄球菌（S. aureus）的细胞壁中。该蛋白可特异性结合IgG的Fc区重链，因此成为将IgG与其他样品组分分离的理想机制。  大多数蛋白A色谱柱是通过将该蛋白固定在多孔有机颗粒上制备而成的。不过，目前也已开发出蛋白A色谱的一体化形式，可在各种流速下实现高样品通量，且不牺牲分离效率。