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大分子HPLC

大分子HPLC

生物分子是活细胞产生的大分子聚合物,作为活生物体的基本组成部分执行许多生命必需的生物过程。生物分子主要类型包括蛋白质、多肽、多核苷酸、糖类、脂质、维生素和辅酶。确定大分子性质和生物分子结构、其化学多样性、生物活性必要性以及复杂基质,都需采取有效的鉴定技术。尽管现有很多分离和分析技术可供选择,最常用的还是高效液相色谱法(HPLC)。凭借丰富的官能团和构象,HPLC生物分子分析提供了反相、体积排阻或离子交换等多样的选择。无论采用哪种分离方式,准确可靠的生物分子分离的关键都是高效的色谱柱填充和一致的固定相颗粒化学。


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  • 体积排阻色谱(SEC)色谱柱和现成的标准品有助于方法开发,并提高蛋白质SEC方法的耐用性。
  • 识别、纠正常见HPLC问题,恢复色谱柱性能。通过色谱图示例,获取解决峰相关问题(峰分裂、峰拖尾、峰前延等)、保留时间、吹扫噪声及分离度下降问题排查帮助。
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Related Protocols


生物分子反相HPLC

反相HPLC(RP-HPLC)是灵敏的通用蛋白、蛋白片段和多肽的分离和分析技术。这一技术使用非极性固定相和极性流动相。其中,蛋白和多肽在固定相上的保留遵循吸附和分配机制。蛋白疏水区可逆吸附于固定相。通过增强流动相的非极性,可洗脱蛋白。分辨率的影响因素包括孔径、颗粒大小、柱长和固定相结合的碳氢链。

体积排阻色谱(SEC)

体积排阻色谱(SEC)是一种按体积大小(如流体动力学半径)分离分子的非变性色谱方法。这种方式利用的并不是分析物和固定相之间的相互作用,而是随机流过固定相颗粒的分析物。高分子量分析物被固定相颗粒孔穴完全或部分排阻在外,较早洗脱;低分子量分析物消耗更多时间在颗粒内部的曲折路径穿流,较晚洗脱。SEC已用于鉴定单克隆抗体(mAb)聚集体和片段、估算未知蛋白分子量以及测定蛋白制剂稳定性。

疏水作用色谱(HIC)

疏水作用色谱(HIC)是根据分析物疏水基团和固定相疏水配体之间相互作用水平来分离分析物的色谱方法。多肽具有较低的分子量和折叠倾向,一般不使用HIC分离。在高盐浓度下,蛋白质水化层会被充分破坏,以至疏水表面区域可与非极性固定相相互作用。盐的选择取决于霍夫梅斯特序列(Hofmeister series),即基于阳离子和阴离子破坏蛋白水化层(离液)或促进水化层形成(亲液)的能力进行的分类。常用盐包括硫酸铵、硫酸钾和硫酸钠。疏水相互作用色谱目前用于抗体药物偶联物(ADC)药物抗体比(DAR)的测定。

离子交换色谱(IEX)

离子交换色谱(IEX)是通过电荷分离分析物的色谱方法。蛋白和多肽都是两性的,即同时表现酸性和碱性。酸性蛋白基团包括天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和C末端α-羧酸酯。碱性蛋白基团包括精氨酸、组氨酸、赖氨酸和N末端α-胺。生物治疗电荷异构体可通过IEX检测和分离。电荷异构体来自信使RNA(mRNA)转录本的错误翻译和/或翻译后修饰,如脱酰胺化、氧化或糖基化。

离子交换色谱必须根据分析物等电点(pI)选择。 如果流动相pH低于等电点,分析物将带上正电荷并与阳离子交换柱结合。 如果流动相pH高于等电点,分析物将带上负电荷并与阴离子交换柱结合。

亲合色谱

亲和色谱依赖分析物和固定相配基之间的特异性相互作用。理想情况下,只有目标分析物结合固定相,其他样品组分则流出色谱柱。其后第二种流动相流过色谱柱洗脱分析物。

蛋白A层析是生物制药行业最常用的亲和层析。 蛋白A是金黄色葡萄球菌细胞壁中发现的42kDa表面蛋白, 因特异性结合免疫球蛋白G(IgG)Fc段的重链而成为在其他样品组分中分离IgG的理想方法。 大多数蛋白质A色谱柱是通过在多孔有机颗粒上固定蛋白生产的。 不过整体式蛋白A色谱柱也已有生产,无需牺牲效率即可在各种流速下实现高样品通量。