Duolink^® PLA多色检测方案

本方案描述了如何使用Duolink^® PLA多色试剂同时检测、可视化和定量一个组织或细胞样本中多达4种的蛋白、蛋白修饰或蛋白互作。

材料与设备

Duolink^® PLA试剂

Duolink^® PLA多色检测实验需要以下Duolink^® PLA多色产品：

• 2至4种Duolink^® PLA多色探针制备试剂盒（可选红色、绿色、橙色和/或远红）试剂盒包含：
  • Duolink^® PLA多色寡核苷酸 2管冻干的活化寡核苷酸（用于偶联一抗）。
    红色寡核苷酸A 与 红色寡核苷酸B，
    绿色寡核苷酸C 与 绿色寡核苷酸D，
    橙色寡核苷酸F 与 橙色寡核苷酸G， 或
    远红寡核苷酸H 与 远红寡核苷酸I
  • 偶联缓冲液 – 用于缓冲偶联反应
  • 终止剂 - 用于终止偶联反应
  • 储存液 - 用于保存寡核苷酸偶联抗体（PLA探针）

  注意：-20 °C保存所有试剂。特定的寡核苷酸对与一抗偶联的详细方法请参阅Duolink^® PLA多色检测探针制备指南。抗体偶联后，将制备好的PLA探针保存在+2-8°C下。切勿冻存。

• Duolink^® PLA多色试剂套装。试剂盒包含：
  • 连接原液(5X) – 稀释配制1X连接缓冲液
  • 连接酶(1 U/μL) – 用于配制连接液
  • 扩增原液(5X) – 稀释配制1X扩增缓冲液
  • 聚合酶 (10 U/μL) - 用于配制扩增液
  • 封闭液 – 用于在孵育抗体前封闭样品
  • Probemaker PLA探针稀释剂– 用于稀释定制PLA探针
  • 检测原液(5X) – 稀释配制1X检测缓冲液

  注意：收到后，可将1X封闭液和1X Probemaker PLA探针稀释剂储存在2-8°C下。其他所有组分-20 °C储存。

• 荧光用洗涤缓冲液 （A和B）
• 含DAPI的^Duolink®封片剂（用于载玻片，储存在+2-8°C）或者细胞核染色剂和抗淬灭剂（用于微孔板，储存在-20°C）

自备材料

• 检测目标蛋白质的一抗。
• 超纯水（无菌过滤，Milli-Q^®或类似水质）
• 载玻片样本（细胞或组织），已经过固定、修复和透化方面的预处理

设备

• 荧光显微镜，带有适当的滤光片、照相机和图像采集软件
• 37°C培养箱
• 水平摇床
• 温湿度箱或微孔板传热块
• 疏水笔，用于给反应区域划界
• 冰块（用于酶）
• 染色罐
• 镊子
• 移液器和吸头（1 μl至1000 μl）
• 盖玻片，适用荧光显微镜

DUOLINK^® PLA多色检测方案

以下实验方案适用于1 cm²的载玻片样品，需要40 µL溶液充分覆盖。

可根据反应面积和样品数量调整溶液体积。所有孵育均应在湿度箱中进行。所有洗涤步骤均应在室温下使用至少70 ml洗涤缓冲液在染色罐中温和搅拌进行。

试剂准备

洗涤缓冲液A和B应在开始检测之前配制，将一袋溶解在高纯度纯水中，定容至1,000 mL。溶液短期（短于两周）室温存放，长期则+2-8 °C储存。

注意：使用前将溶液升温至室温。

• 0.01X洗涤缓冲液B应在开始检测之前用超纯水1:100稀释1X洗涤缓冲液B配制。
• 许多Duolink^® PLA试剂以浓缩原液形式提供，应在临用前稀释。请勿储存稀释后的Duolink^® PLA试剂。

Duolink^® PLA多色实验方案

在开始之前，将样品沉积在载玻片上，并经过固定、恢复和/或透化方面的预处理。

• 封闭
  注意：使用前拧紧1X封闭液的盖子，因为冻融过程中滴瓶盖可能会松脱。+2-8°C储存。
  • 每1 cm2样本滴加1滴(~40 µL)Duolink^®封闭液。务必保证用封闭液完全盖住整个样本。
  • 在温湿度箱中37°C孵育载玻片60分钟。
    
    
• 一抗孵育
  注意：在添加抗体之前请勿让载玻片干燥，否则会导致背景。
  • 用Probemaker PLA探针稀释剂一起稀释所有寡核苷酸偶联一抗。按照在单色Duolink^® PLA检测中发挥最佳抗体性能的浓度稀释。
  • 拍掉玻片上的封闭液。
  • 每个样本加入一抗溶液。
  • 在湿度箱中孵育玻片。采用适合所有一抗的最佳孵育温度和时间。
  注意：直接检测（寡核苷酸偶联一抗）不一定能获得与间接检测（一抗和PLA探针试剂组合）相同的结果。可能需要做些额外优化。
  
• 连接
  注意：连接酶要等到需要添加到样品中时再添加。确保连接缓冲液在使用前完全解冻。
  • 拍掉玻片上的一抗液体。
  • 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
  • 在洗涤过程中，配制连接液。涡旋混匀5x多色PLA连接缓冲液。
  • 超纯水1:5稀释5x多色PLA连接缓冲液并混匀。对于40 µL反应，将8 µL 5x连接缓冲液加到30 µL超纯水中（减去连接酶体积）。为所有样品制备足量的溶液。
  • 使用冰块恢复从冰箱里取出的连接酶(-20 °C)。
  • 用1x连接缓冲液1:20稀释连接酶并混匀。对于40 µL连接液，将2 µL连接酶加到38 µL 1x连接缓冲液中。
  • 拍掉多余的洗涤缓冲液，加入连接液。
  • 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片30分钟。
  注意：连接酶也可用1x连接缓冲液1:40稀释，但相应地37 °C下的反应时间也要延长到60分钟。
  
• 扩增
  注意：聚合酶要等到需要添加到样品中时立即添加。
  • 拍掉玻片上的连接液。
  • 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
  • 在洗涤过程中，配制扩增液。涡旋混匀5x扩增缓冲液。
  • 用超纯水1:5稀释5x扩增缓冲液并混匀。对于40 µL反应，将8 µL 5x扩增缓冲液加到31 µL超纯水中（减去聚合酶体积）。为所有样品制备足量的溶液。
  • 使用冰块恢复从冰箱里取出的聚合酶(-20°C)。
  • 用1x扩增缓冲液1:40稀释聚合酶并混匀。对于40 µL反应，将1 µL聚合酶加到39 µL 1x扩增缓冲液中。
  • 拍掉多余的洗涤缓冲液，加入扩增液。
  • 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片100分钟。
    
• 检测
  注意：多色PLA检测缓冲液对光敏感。需避光使用所有含缓冲液的溶液。
  • 拍掉玻片上的扩增液。
  • 用1x洗涤缓冲液A室温洗涤玻片3x5分钟。
  • 在洗涤过程中，配制检测液。涡旋混匀5x多色PLA检测缓冲液。
  • 用超纯水1:5稀释5x多色PLA检测缓冲液并混匀。对于40 µL反应，将8 µL 5x检测缓冲液加到32 µL超纯水中。为所有样品制备足量的溶液。
  • 拍掉多余的洗涤缓冲液，加入检测液。
  • 在预热的温湿度箱中37 °C孵育玻片30分钟。
    
• 最终洗涤
  注意：试剂对光敏感。全程避光保护玻片。
  • 拍掉玻片上的检测液
  • 用1x洗涤缓冲液B室温洗涤玻片2x 10分钟
  • 用0.01X 洗涤缓冲液B洗涤玻片1分钟
    
• 成像准备
  注意：Duolink^®原位封片剂（含DAPI）是液态的，不会固化。可用干净的指甲油密封盖玻片和载玻片的边缘。避免在盖玻片下制造气泡。
  • 拍掉载玻片上多余的洗涤缓冲液。
  • 用尽可能少的Duolink^® PLA封片剂（含DAPI）封住载玻片和盖玻片。
  • 静置15分钟后使用20倍物镜，在荧光或共聚焦显微镜中分析。

结果

图像采集

使用荧光显微镜，并根据检测荧光染料选用合适的滤光片，检查Duolink^® PLA多色实验结果。Duolink^® PLA信号表现为散落在细胞各个部位的荧光点（图1A）。每个信号为亚微米大小，可能处在多个焦平面上。因此，需要扫遍整个样本厚度来获得图像。注意，当进行直接检测的Duolink^® PLA时（即剔除寡核苷酸偶联一抗时），不应检测到PLA信号。如有可能，应设置生物学对照（图1B）。

根据信号强度的不同，每种荧光染料的采集参数（曝光时间、增益等）也会不同。但切记在单次实验中，对所有样本都要采取针对每种荧光染料优化的相同的图像捕获参数。使用阳性和阴性对照可优化参数设置。当PLA信号数较多时，PLA信号会合并/重叠（图2）。这种情况在研究高表达蛋白或图像捕获过曝时都会发生。因此需要小心设置采集参数并采用合适的一抗滴度，以获得分散的PLA信号。

PLA信号可通过多种图像分析工具定量。使用图像数据可分析PLA信号的平均荧光强度和/或每个细胞或细胞每个区域的PLA信号总数（图3）。定量结果表示为相对同一实验中技术和/或生物学对照的数值。不过只有当PLA信号没有重叠且像素未饱和时，才有可能进行可靠定量。