原代细胞最接近起源组织。它们直接从组织中取出并经过处理,以在最佳培养条件下建立。由于它们源自组织且未经修饰,因此与体内状态更加相似,并表现出正常的生理学特征。因此,它们为研究细胞的正常生理学和生物化学性质(例如,代谢研究、衰老、信号传导研究)以及药物和有毒化合物对细胞的作用,提供了出色的模型系统。但须记住,原代细胞的寿命有限,经过一定次数的细胞分裂后将停止分裂(或衰老),比连续细胞系更难以培养和维持。研究细胞信号通路的研究人员面临的主要挑战是从供体获得和传代培养过程中诱导发生的原代细胞变异。研究人员倾向于在着手进行信号研究之前,筛选细胞对常见刺激的敏感性。预先筛选的原代细胞可以刺激激活主要信号通路,从而节省了宝贵的资源。
研究中最常用的原代细胞类型是上皮细胞、成纤维细胞、角质形成细胞、黑素细胞、内皮细胞、肌肉细胞、造血和间充质干细胞。最初的培养物是异质的(即组织中存在多种细胞类型的混合物),只能在有限的时间范围内在体外进行培养。可通过称为转化的体外过程对原代细胞进行无限次传代培养。转化可以自发发生,也可以化学或病毒诱导。原代培养经过遗传转化(提供适当的新鲜培养基和空间)后,它们会无限分裂并成为永生化的二代细胞系。
图 1.生物医学研究中常用的原代细胞实例。
原代细胞培养越来越多地被用作细胞和分子生物学的主要工具,为研究细胞的正常生理学和生物化学(例如代谢研究、衰老、信号传导研究)、药物和有毒化合物对细胞的影响、诱变和致癌作用等,提供了优秀的模型系统。它还用于药物筛选以及大规模开发生物化合物(例如疫苗、治疗性蛋白质)。
图 2.3D人体皮肤模型可以用作化妆品行业动物测试的替代方法。使用人类原代皮肤成纤维细胞、角质形成细胞和黑素细胞对3D皮肤模型进行 A)H&E、B)BrdU 和 C)丝蛋白染色。
原代细胞可以悬浮或贴壁生长。一些细胞天生存在于悬浮状态,而不附着于表面(例如来自外周血的那些细胞)。还有一些细胞系经过修饰,能够在悬浮培养中存活,它们的生长密度高于贴壁培养条件所允许的密度。对于锚定依赖性原代细胞,贴壁细胞(如实体组织)需要贴附一个表面才能在体外适当生长。这些细胞大多在平坦的未包被的塑料容器中培养,但有时使用包被有细胞外基质(例如胶原蛋白和层粘连蛋白)组分的微载体可以提高粘附性,并提供生长和分化所需的其他信号。细胞培养基由补充有适当生长因子和细胞因子的基础培养基组成。细胞在细胞培养箱以合适的温度和气体混合(对于哺乳动物细胞,通常为37℃,5% CO2)生长和维持。培养条件视细胞类型的不同而有很大差异。生长培养基的pH、葡萄糖浓度、生长因子和其他营养素的存在,可以随细胞类型的不同而不同。
在建立原代培养期间,必须在生长培养基中包含抗生素,以抑制从宿主组织引入的污染。使用的抗生素可能包括庆大霉素、青霉素、链霉素和两性霉素B的混合物。但是不建议长期使用抗生素,因为长期使用某些试剂(如两性霉素B)可能对细胞有毒。
分离后,保持原代细胞的活力非常重要,因为它们中的大多数经历了衰老过程,并且经过一定次数的群体倍增后会停止分裂。对于细胞的长期生存能力,优良的细胞培养处理技能以及适当的培养条件(即生长培养基、温度、气体混合物、pH、生长因子浓度、营养物和葡萄糖的存在)是必不可少的。用于补充培养基的生长因子通常来自动物血液(血液衍生成分具有污染的可能性),建议尽可能减少或避免使用这些成分。使用无菌技术也是必要的。
细胞汇合度通常是指附着的细胞所栖息的培养容器面积的百分比。例如,100%细胞汇合度意味着表面区域被细胞完全覆盖,而50%汇合度意味着大约一半的表面被覆盖。它是在原代细胞培养中追踪和评估的重要且必要的参数,因为各种细胞类型要求不同的汇合终点,在汇合终点,需要对它们进行传代培养。
当分离的细胞附着在培养皿的表面时,细胞的维持阶段开始。细胞附着通常在培养开始后约24小时完成。当细胞达到所需的细胞汇合度并且正在活跃增殖时,就需要进行传代培养。这是在达到100%汇合度之前传代培养原代细胞培养物的最佳时间,因为汇合后细胞可能会经历分化,并且在传代后表现出较慢的增殖。
锚定依赖性细胞以单层生长,需要用适当的培养基定期进行传代培养,以维持指数生长。单层的传代培养涉及胞间和胞内与附着表面之间键的断裂。大多数贴壁原代细胞需要消化它们的蛋白质附着键,或用低浓度的蛋白水解酶(例如胰蛋白酶 / EDTA)从单层或相关组织上分离。在细胞解离并分散成单细胞悬液后,将它们计数并稀释至适当浓度,然后转移至新鲜的培养容器(培养基的组成随细胞类型的不同而不同),在那里它们将重新附着并分裂。
血细胞计数器通常用于估计细胞数和确定细胞活力(可以使用排除染料,例如台盼蓝)。血细胞计数器是一种相当厚的玻璃显微镜载玻片,有一个矩形凹槽。 凹槽有激光精确蚀刻的垂直线网格。网格的面积和凹槽的深度是已知的。因此,可以计算特定体积的液体中的细胞数量,从而计算液体的总体细胞浓度。
冷冻保存是用低温保存结构完整的活细胞的过程。正确地冷冻保存和解冻原代细胞极为重要,以使每个过程中细胞的损害和死亡降至最低。对于人细胞,一般通过使用冷冻保护剂,例如DMSO或甘油(在正确温度下并且以受控的冷冻速率冷冻)来实现。对于大多数原代细胞,可以在补充有10% FBS和10% DMSO的80%完全生长培养基的混合物中实现冷冻保存。冷冻过程需要以每分钟降低1℃的速度缓慢进行,以最大限度地减小细胞内冰晶的形成。冷冻培养物需要储存在液氮(-196℃)或-130℃以下的气相中。
解冻冷冻保存的细胞的方法是将冷冻细胞浸入37℃水浴中约1至2分钟,这是一个快速完成的过程。应注意不要在解冻后离心原代细胞(因为在它们从冷冻保存中恢复的过程中极易受损伤)。解冻后最好立刻接种细胞,并且让培养物在最初的24小时内附着。1在开始培养冷冻保存的原代细胞时,一旦细胞附着,必须立刻除去用过的培养基(因为DMSO对原代细胞有害,并且可能导致解冻后活力下降)。
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