酶促半乳糖和乳糖检测实验方案

该检测实验方案适用于使用半乳糖和乳糖检测试剂盒(MAK011)，对细胞和组织培养的上清液、尿液、血浆、血清和其他生物样品中的半乳糖和乳糖进行比色/荧光检测。在该检测试剂盒中，半乳糖被半乳糖氧化酶氧化，产生比色(570 nm)/荧光(λ_ex = 535 nm/λ_em = 587 nm) 产物，且产物量与所含的半乳糖成比例。在进行乳糖检测时，乳糖会被乳糖酶水解以生成游离的半乳糖，然后再测量其含量（总半乳糖）。乳糖含量等于总半乳糖减去游离半乳糖的量。对于荧光检测，该试剂盒具有0.2-1.0 nmol半乳糖的线性检测范围，对于比色检测，则为2-10 nmol半乳糖检测范围。 

注意事项和免责声明

本产品仅可用于研发用途，不可用于药物、家用或其他用途。请参阅产品化学品安全技术说明书，获取危害和安全操作方法相关信息。 

试剂

半乳糖检测缓冲液                                            25 mL
    货号MAK011A
 
半乳糖探针，溶于DMSO                                      0.2 mL
    货号MAK011B
 
乳糖酶                                                                  1 vl
    货号MAK011C
 
半乳糖酶混合物                                           1 vl
    货号MAK011D
 
辣根过氧化物酶                                          1 vl
    货号MAK011E
 
半乳糖标准品，100 nmole/µL                         0.1 mL
    货号MAK011F

需自备的试剂和设备

96孔平底板 - 建议使用带有透明底部的黑色平板（货号M5686或同类产品）进行荧光测定，使用透明板（货号M4436或同类产品）进行比色测定。

荧光或分光光度计多孔板读数器

制备说明

样品瓶启封之前，短暂离心。使用超纯水制备试剂。为维持试剂的完整性，请避免反复冷融循环。

半乳糖检测缓冲液——使用前放置至室温。

半乳糖探针—— 即用型，按供应原样使用。使用前让探针达到室温。–20 °C条件下避光干燥储存。在2个月内使用。

乳糖酶、半乳糖酶混合物、辣根过氧化物酶 - 分别用220 μL半乳糖检测缓冲液进行重悬。反复移液以充分混合，等量分装后于-20 °C避光保存。在溶解后2个月内使用完。

储存方法/稳定性

本试剂盒在湿冰上运输。建议–20°C避光储存。

操作流程

所有样品和标准品应一式两份运行。

用于比色检测的半乳糖标准品
用990μL半乳糖检测缓冲液稀释10μL的100 mM（100 nmole /μL）半乳糖标准溶液制备1 mM（1 nmole/μL）的标准溶液。充分混合后，加入0、2、4、6、8和10μL的1 mM半乳糖标准溶液至96孔板中，配制成0（检测空白）、2、4、6、8和10 nmole /孔的标准溶液。向每个孔中加入半乳糖检测缓冲液，使终体积达到50 μL。

用于荧光检测的半乳糖标准品
对于比色测定，准备1 mM半乳糖标准溶液。用180μL半乳糖检测缓冲液稀释20μL的1 mM标准溶液，以制备0.1 mM (0.1 nmole/μL)标准溶液。将0、2、4、6、8和10μL的0.1 mM半乳糖标准溶液加入至96孔板中，配制成0（检测空白）、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 nmole /孔的标准溶液。向每个孔中加入半乳糖检测缓冲液，使终体积达到50 μL。

样品制备
比色法和荧光法检测每个反应（孔）都需要50 μL的样品。

液体样品可直接加入到孔中。牛奶中通常含有2-8%的乳糖。加入0.01–0.1 μL的牛奶样品到孔中。用半乳糖检测缓冲液将所有样品的终体积达到50 μL。

对于未知样品，建议测试几份样品稀释液，确保读数在标准曲线的线性范围内。

检测反应
注意：在检测乳糖时，每个样品准备两个孔。向一个孔中加入2 μL乳糖酶，以将乳糖转化为半乳糖和葡萄糖（总半乳糖检测）。不要向另一孔中加入乳糖酶（游离乳糖检测）。在37 °C孵育30分钟。

1.     根据表1中的方案配制反应预混液。每个反应（孔）需要50μL反应预混液。

2.     向每个孔中加入50μL反应预混液。使用水平振荡器或通过移液枪充分混合，并在37℃下孵育反应60分钟。在孵育期间需保证避光。

3.     对于比色测定，测定570 nm处的吸光度(A₅₇₀)。对于荧光法检测，测定荧光强度（λex = 535/λem = 590 nm）。

结果

计算
设置半乳糖标准品中空白组所对应的值为背景值。通过从所有读数中减去空白组吸光值来校正背景。背景值可能很高，必须从所有读数中减去。使用相应的半乳糖标准品的吸光值绘制标准曲线。
注意：每次运行测定方案时，都必须绘制新标准曲线。

半乳糖浓度

S_a/S_v = C

S_a = 未知样品中半乳糖的量 (nmole)
（来自标准曲线）
S_v = 加入到孔中的样品体积 (mL)
C = 样品中的半乳糖浓度

样品计算
半乳糖的量 (S_a) = 5.84 nmole
（来自标准曲线）
样品体积 (S_v) = 50 μL

半乳糖的分子量 = 180.16

样品中的半乳糖浓度

5.84 nmole/50 μL = 0.1168 nmole/μL
0.1168 nmole/μL x 180.16 ng/nmole = 21.04 ng/μL

乳糖量 = 总半乳糖量 - 游离乳糖量